肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis facter-related poptosis-inducing ligand，TRAIL)为TNF超家族之一，其通过与死亡受体（TRAIL-R1和TRAIL-R2）结合，选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡。TRAIL这种特异性杀伤肿瘤的特性，使其成为恶性肿瘤生物靶向治疗的潜在药物。以TRAIL为基础的肿瘤治疗策略包括重组可溶性TRAIL、TRAIL受体激动剂和基因治疗等，其中重组TRAIL的研究和应用最多。然而由于重组TRAIL的活性依赖于其同源三聚体形式，导致其存在稳定性差、半衰期短等不足，因而限制了其临床应用。因此，通过生物工程技术获得更为稳定的三聚体形式的重组TRAIL对于其进一步应用以及恶性肿瘤的有效治疗十分重要。
　　课题组前期通过序列和结构设计，利用禽类1型腺病毒(FAV1)纤毛蛋白(Fiber)的tail和shaft结构域对可溶性TRAIL(soluble TRAIL,sTR)进行修饰，发现融合蛋白FAIFT具有很好的体内外稳定性及体外抗肿瘤活性，然而FAIFT在体内具有较强的肝富集性进而限制了其体内活性。为进一步提升FAIFT的应用前景，本课题设计通过两种不同的策略对FA1FT进行优化，以降低其肝富集并增强肿瘤靶向能力，具体包括：(1)通过分析鉴定禽类1型腺病毒Fiber序列可能的肝靶向位点，对其进行突变或删除来降低肝富集；(2)通过pH靶向肽修饰，依赖pH靶向肽特异性靶向肿瘤酸性环境，提升FA1FT在肿瘤处的富集增强其肿瘤靶向性进而降低肝富集性。
　　第一部分设计中，经序列比对分析及文献查阅，将FAV1-tail上有三个连续的带正电碱性氨基酸的非经典HSPG结合位点KRK突变为GAG，得到蛋白mut-FA1FT，该蛋白虽具有很好的杀伤活性，蛋白肝细胞结合实验结果却显示KRK的突变并不能减少与肝细胞的结合，但从肝素钠封闭实验中得到验证：KRK与HSPG结合是相关的，进而说明蛋白中还存在非HSPG相关序列影响肝富集。为探究FAV1-Fiber中非HSPG相关序列，经文献调研及实验室前期经验，对FAV1-Fiber进行截短，设计了无tail的FAV1-shaft-sTR(FA1ST)和tail+shaft的最后一个螺旋结构的FAV1-tail-1ast shaft-sTR(FA1TLST)两种蛋白，两种蛋白均具有良好的杀伤活性，肝细胞结合实验中，FAIST和FAIFT相比并未减少与肝细胞的结合反而有增加趋势，而FA1TLST与FAIFT相比结合大幅下降，但仍有53%的结合；在肝素钠结合实验中，肝素钠的封闭更高效的降低FA1TLST与肝细胞的结合，故排除掉FA1TLST中HSPG结合位点为下一步研究重点。综合上述结果，在FA1TLST基础上将FA1TLST序列中tail的KRK突变为GAG，得到蛋白mut-FA1TLST，但在体外实验中mut-FA1TLST和FAITLST与肝细胞结合率相类似。
　　第二部分设计中，通过pHLIP靶向肽修饰来提升肿瘤靶向并降低肝富集。pHLIP(pH membrane insertion peptide)，是一种短的pH响应肽，为靶向酸性组织提供了新的机会，可在酸性条件下将其C末端插入细胞膜并形成跨膜螺旋，可实现在肿瘤处治疗药物富集及肿瘤靶向。本课题根据TRAIL的结构和功能特点，设计了FA1FT-pHLIP及FA1FT-1inker-pHLIP两种蛋白形式。由于pHLIP在酸性环境中易形成α螺旋锚定在膜上，在原核表达时，经过长时间的诱导，培养基处于酸性环境，使得蛋白更多的锚定在大肠杆菌的膜上而不能上清表达蛋白，我们通过透析的方式对包涵体中的蛋白进行纯化，纯化效率能达到40-50%。在体外检测中，通过MTT及凋亡试剂盒检测重组蛋白的生物活性，结果发现FA1FT-Iinker-pHLIP能够维持FAIFT较强的肿瘤凋亡和抑制活性，而FA1FT-pHLIP则略有降低。为验证修饰后蛋白的肿瘤组织靶向性，将蛋白分别在pH为7.4及6.5的环境下与细胞40C孵育，通过共聚焦免疫荧光和流式细胞仪检测发现，在酸性条件下FA1FT-1inker-pHLIP相比FA1FT-pHLIP，能更好地与肿瘤细胞结合。
　　通过本论文研究得到以下结论：通过体外实验对FA1FT中肝富集序列进行分析，获得了可降低肝富集并维持其高效肿瘤杀伤活性的新型重组TRAIL蛋白；pHLIP靶向肽修饰能有效增强FA1FT蛋白的肿瘤靶向能力，具有良好抗肿瘤前景。后续将开展体内靶向和治疗实验，进一步评价上述改造和修饰在体内对肿瘤细胞的影响，这将为重组蛋白未来的研究奠定良好的基础。