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背景骨肉瘤是一种高度恶性的骨肿瘤,死亡率高,常发生于儿童或者青少年。尽管近几十年来,骨肉瘤治疗技术的不断进步,如手术治疗,假体置换,联合化疗等,但是骨肉瘤患者的预后仍然不理想。骨肉瘤的早期转移、复发、药物抵抗以及其它继发性肿瘤仍然是广大医务人员面临的难题。因此,了解骨肉瘤细胞增殖、侵袭以及凋亡的信号通路对于获得更加有效的治疗显得尤为重要。Micro RNAs(mi RNAs)是一类内源性的非编码小RNA分子,约20~25个核苷酸大小,广泛存在于真核生物,在转录后水平调控可能的靶m RNAs。mi RNAs在很多肿瘤中异常表达,它们与肿瘤相关的进程密切相关。大量研究发现mi RNAs在不同的生物进程中起着癌基因或抑癌基因的作用。因此,越来越多的关于mi RNAs对肿瘤相关进程影响的研究正在进行。研究发现micro RNA-21(mi R-21)在很多肿瘤中通常起着癌基因的作用,在很多肿瘤中通常呈高表达。然而,有关mi R-21在骨肉瘤中所起作用的研究并不十分明确。因此,本实验以mi R-21作为主要研究目标,研究其在骨肉瘤细胞MG63增殖、侵袭以及凋亡中的所起的作用以及可能的作用机制。目的通过对mi R-21在骨肉瘤细胞MG63中功能的研究,探讨mi R-21对骨肉瘤细胞MG63的调节机制,为临床骨肉瘤的治疗提供一种新的思路。方法(1)本实验通过转染人工合成的寡核苷酸片段(mi R-21抑制物:anti-21;mi R-21模拟物:mi-21;无关序列:Scr)来调节mi R-21在骨肉瘤细胞MG63中表达水平,进而研究mi R-21在骨肉瘤细胞MG63中所起的作用。通过实时定量PCR技术检测mi R-21在骨肉瘤细胞MG63中表达水平的差异。以未转染的MG63细胞(blank组)作为对照。(2)通过上调及下调mi R-21在骨肉瘤细胞MG63中的表达水平来研究骨肉瘤细胞的增殖能力、细胞周期、侵袭能力以及细胞凋亡。(3)通过调节mi R-21在骨肉瘤细胞MG63中表达,来研究mi R-21与骨肉瘤细胞对顺铂耐药性的关系。(4)采用mi RNA基因组数据库来验证mi R-21在骨肉瘤细胞MG63中调节靶基因PDCD4的表达水平。通过生物信息学技术(Pic Tar,mi Randa,Target Scan)寻找以PDCD4编码或非编码序列为靶基因的mi RNAs。(5)为进一步验证在骨肉瘤细胞MG63中mi R-21和PDCD4表达水平的关系,采用实时定量PCR技术检测转染mi R-21模拟物、mi R-21抑制剂后PDCD4-m RNA的水平,Western blotting观察PDCD4蛋白水平的变化。(6)通过构建荧光报告基因进一步验证PDCD4是mi R-21的靶基因。同时采用免疫组织印染技术检测转染mi R-21模拟物、mi R-21抑制剂后PDCD4的表达。结果(1)实时定量PCR检测mi R-21的表达,结果表明转染mi R-21抑制剂后,与blank组相比显著抑制了mi R-21的表达水平。转染mi R-21模拟物后,与blank组相比显著上调了mi R-21的表达水平(P<0.05)。(2)上调mi R-21的表达水平后,与blank组相比细胞生长能力增强,下调mi R-21的表达水平后,细胞生长受抑制。流式细胞学检测细胞周期结果显示:上调mi R-21的表达水平后,与blank组比较,细胞均增殖能力增强,并且呈现较低的G0/G1期细胞比率和较高的S期细胞比率。与之相反的是,下调mi R-21的表达水平后,细胞增殖能力受抑制,并且呈现较高的G0/G1期细胞比率和较低的S期细胞比率。无关序列转染组(Scr组)与blank组无明显差异。G2/M期各组细胞比率无统计学差异。以上结果表明mi R-21可以诱导骨肉瘤细胞MG63的增殖。流式细胞凋亡实验显示:上调mi R-21的表达水平后,与blank组比较,显著降低了细胞凋亡率,而下调mi R-21的表达水平后,显著增加了细胞凋亡率。Scr组与blank组无明显统计学差异。细胞侵袭试验显示:转染anti-21后,与blank组相比较细胞侵袭能力显著受抑制,而转染mi-21后,细胞侵袭能力显著增强。Scr组与blank组无明显统计学差异。以上结果进一步证明了mi R-21是促进骨肉瘤细胞侵袭能力的重要因子。(3)通过转染mi-21、anti-21调节细胞内mi R-21表达水平,来研究mi R-21与骨肉瘤细胞MG63对顺铂耐药性的关系。(4)生物信息学技术预测mi RNAs靶向作用于PDCD4的编码或非编码序列显示人类基因PDCD4的3′-UTR区域包含mi R-21的靶位点。(5)Western Blotting结果显示:转染mi-21后,内源性的PDCD4条带较blank组明显减弱,实时定量PCR显示内源性的PDCD4-m RNA表达水平明显降低。而转染anti-21后,结果与转染mi-21相反。(6)荧光报告基因显示转染mi-21后构建的荧光报告基因载体p MIR-PDCD4-3’-UTR活性明显降低,免疫组织化学显示细胞膜PDCD4蛋白染色减弱同时伴随细胞的高增殖性。而转染anti-21后呈现相反的结果。结论(1)转染mi-21或anti-21可以显著上调或下调骨肉瘤细胞MG63的mi R-21表达水平。(2)mi-21可以显著促进细胞增殖、增强细胞的侵袭能力并且降低细胞凋亡,anti-21可以显著降低细胞增殖、减弱细胞的侵袭能力并且诱导细胞凋亡。这些结果提示mi R-21在骨肉瘤细胞MG63中起癌基因的作用。(3)改变细胞内mi R-21表达水平可以影响骨肉瘤细胞对顺铂的耐受性。(4)PDCD4蛋白水平与mi R-21表达水平在很多肿瘤中呈负相关,在骨肉瘤细胞MG63中PDCD4-m RNA也是mi R-21的一个直接功能靶基因。mi R-21通过下调PDCD4表达水平在骨肉瘤细胞中起着癌基因的作用。