研究背景胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,其恶性程度高、预后差。近年来,胰腺癌的发病率在全球都有不断升高的趋势。由于胰腺癌发病早期并无明显的症状体征,早期的临床诊断和干预非常困难,加之手术切除率和5年生存率低,是目前严重威胁人类健康的恶性疾病之一。多年来,国内外众多学者已经从基因水平对胰腺癌进行了大量的研究。但是,基因只是遗传信息的载体,生命活动的本质是蛋白质作用的结果。只有对蛋白质性质、相互关系和生物功能全面认识,才能揭开生命现象的本质。细胞膜作为细胞与外界环境之间的屏障,在维持细胞的微环境、介导细胞与外界环境以及细胞与细胞之间的能量传递、物质运输、信号转导等生命活动中发挥了重要的作用。通过不同功能蛋白质在时间和空间上有序和协同作用,大量的生理功能才得以执行。目前,膜蛋白质组学已经成为蛋白质组学研究的重要组成部分,应用膜蛋白质组学技术有助于进行疾病发病机制的研究。因此,本实验计划通过蛋白质组学技术筛选胰腺癌细胞表达的膜相关蛋白,并对目标蛋白质进行生物学功能研究和临床病理验证,以期筛选有价值的功能蛋白质,进而探索胰腺癌发病机制和寻找胰腺癌治疗的潜在靶点。研究目的1.寻求和建立新的膜蛋白质组学研究系统,实现对膜蛋白质进行有效的提取、分离和鉴定。2.通过对胰腺癌PANC-1细胞的膜蛋白进行蛋白质组学研究,筛选有意义的胰腺癌膜蛋白肿瘤标记物。3.深入研究筛选出的膜蛋白的生物学功能,并在已经确诊的胰腺癌标本上验证目标蛋白的表达情况,进一步探索目标蛋白在胰腺癌发病机制中的作用,为胰腺癌早期临床诊断和干预提供思路。研究方法1.体外培养胰腺癌PANC-1细胞,应用双水相提取技术(PEG/Dextran)提取膜蛋白,分别以ASB-14和CHAPS作为蛋白裂解液中的两性离子去垢剂,通过双向电泳进行蛋白质分离。对分离的蛋白质进行MALDI-TOF/TOFMS质谱鉴定,并应用GOA、DAVID、STRING等生物信息学软件进行分析。2.通过siRNA干扰技术抑制抗增殖蛋白PHB1的表达,以临床化疗药物Doxorubicin诱导人胰腺癌PANC-1细胞和Bx-PC3细胞凋亡为研究模型,探讨PHB1在胰腺癌细胞凋亡中的分子功能。3.收集不同分化程度胰腺癌标本,利用免疫组织化学方法分析所筛选的膜蛋白PHB1在胰腺导管腺癌组织和癌旁组织中的表达情况。研究结果1.成功建立了双水相体系提取细胞膜蛋白的方法,并通过改良电泳裂解液组分增加了膜蛋白的溶解性,提高了膜蛋白分离鉴定效果。利用该方法成功分离了53种蛋白质分子,其中50种蛋白质分子有GOA注释,32个蛋白质分子为膜相关蛋白。2.生物信息学软件分析证实32种膜相关蛋白与代谢途径密切相关。其中PHB1基因在胰腺癌中的生物学功能尚不清楚,本实验选择对PHB1的生物学功能进行深入研究。3. siRNA干扰技术抑制PHB1的表达,化疗药物Doxorubicin诱导人胰腺癌PANC-1细胞和Bx-PC3细胞的凋亡后,Western blot结果显示凋亡相关蛋白CASP3和PARP1表达水平显著下调。PHB1是胰腺癌细胞凋亡过程中的重要分子,提示PHB1可作为胰腺癌肿瘤化疗治疗的潜在靶点。4.应用免疫组织化学方法对11例胰腺癌临床标本中PHB1的表达情况分析结果表明,PHB1在胰腺导管腺癌的癌旁组织中均有高表达,且高于不同分化的癌组织；不同分化的胰腺癌组织中均有PHB1的表达,并低于胰腺癌组织周围癌旁组织(即正常胰腺组织)的表达水平,且随胰腺导管癌分化水平降低,PHB1表达呈下降趋势。结论1.双水相技术结合改良的双向电泳技术联合质谱分析可以快速提取、分离、鉴定膜相关蛋白质,具有良好的膜蛋白提取率和鉴定率。2.细胞生物学功能分析结果显示,在化疗药物作用下,抑制PHB1表达后胰腺癌细胞凋亡相关蛋白表达明显降低少,因此PHB1是胰腺癌细胞凋亡过程中的重要分子,提示PHB1可作为胰腺癌化疗的潜在靶点。3.PHB1可以作为胰腺癌组织和癌旁组织的鉴别指标。在不同分化程度的胰腺癌组织中,PHB1可能是评价胰腺导管腺癌分化程度的指标。