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青春期是人体生长发育的第二个高峰期,也是骨量大量积累进而影响骨峰值的最敏感时期。骨峰值是个体在遗传背景许可的范围内获得的最大骨量值,它是决定个体BMD的最主要因素,并可能影响其生命后期骨质疏松的发病危险。目前认为,骨量增长受遗传因素和钙摄入量、体力活动等多种环境因素的综合影响。孪生子和家族研究表明,遗传因素可以决定个体骨峰值的85%,而且遗传因素对骨量的这种影响作用在儿童和青少年尤为明显。因此确定青春期个体低骨量的遗传学标志对于其获取最大骨峰值进而早期预防骨质疏松具有重要意义。
研究目的:1.通过对OPG、COL1A2和TGF-β1基因多态性位点基因型分布检测,了解健康女童OPG、COL1A2和TGF-β1基因多态性分布频率并探讨其对骨密度的影响,为我国低骨量个体的筛查提供有价值的遗传学标志。
2.探讨不同钙摄入水平对青春前期女童骨量的影响。
3.探讨两种基因以及基因和钙摄入水平对青春前期女童BMD的交互作用。
(拟选取下列7对研究因素作交互作用分析:COL1A2*OPGT950C,COL1A2*OPGT245G,COL1A2*OPGA163G,COL1A2*Ca,OPGT950C*Ca,OPGT245G*Ca,OPGA163G*Ca)
研究方法:1.研究对象选择在广州市从化英豪学校、广州市登峰小学、广州市荔湾区华侨小学和南海南师附属小学3~4年级的学生中按规定的纳入标准选择年龄在9~11.5岁未月经初潮的女童。所有对象均由家长签署知情同意书后进入实验研究。
2.膳食调查采用3天膳食回顾法调查研究对象中三分之二走读生3天的食物摄入种类和数量,对在校午餐者,进行食物摄入种类和数量的核实。另三分之一全寄宿学生用称重法称量3日摄入食物种类和数量。所得的数据,用营养计算软件V1.6计算膳食钙、蛋白质等营养素的摄入量。
3.骨密度检测采用双能X线骨密度仪(DualenergyX-rayAbsorptiometry,DEXA)测定全身、L1-L4腰椎、左侧近端股骨(包括股骨颈、大转子和Wards三角区)的BMD、BMC及体成分(LBM、FM、%FM)。
4.骨代谢相关指标检测血清骨钙素(OC),放射免疫法;血清护骨素(OPG),ELISA法;血清雌激素(E2),ELISA法;尿脱氧吡啶啉(Dpd),ELISA法,尿肌酐(Cr),苦味酸法。
5.基因多态性检测采用改良的上海生工试剂盒法提取血液基因组DNA;采用PCR-RFLP技术检测OPG基因T950C、T245G、A163G位点和COL1A2基因MspⅠ位点及TGF-β1基因T861-20C位点多态性。
6.数据处理与统计分析实验数据用MicrosoftExcel2003建立数据库,使用SPSSforWindows11.0进行统计分析,两组间比较采用LSD-t检验,检验有统计学意义水平为0.05。
采用x2检验对三种基因5个位点的基因型频率进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验;各个基因型间的计量资料比较采用单因素方差分析(oneway-ANOVA);三种钙摄入水平之间和各基因型之间骨密度的比较及交互作用检验均采用协方差分析(ANCOVA)。
结果:1.对象一般情况本研究共有214名研究对象,均为汉族青春前期女童,平均年龄为10.07岁±0.72岁;平均身高为138.97cm±6.96cm;平均体重为31.54kg±5.73kg;膳食钙平均摄入量为648.91mg/d±263.39mg/d,低于该年龄段的每日膳食参考摄入量(800mg/d);膳食蛋白质平均摄入量为67.12g/d±18.25g/d;雌激素平均水平用Md±Q表示,为0.66ng/ml±1.06ng/ml;性成熟度Tanner分级在SMR1~SMR3之间。
2.5个位点多态性分布规律在本次研究214名青春前期女童中,未发现TGF-β1基因T861-20C位点存在多态性。OPG基因3个位点基因型分布频率分别为:T950C:TT-41.1%,TC-50.5%,CC-8.4%;T245G:TT-77.1%,TG-21.5%,GG-1.4%;A163G:AA-74.8%,AG-21.5%,GG-3.7%;COL1A2基因型分布频为:mm-73.4%,Mm-24.3%,MM-2.3%。经?2检验,4个位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。
3.钙摄入量与青春期女童骨密度本研究按照钙摄入量<500mg/d、500-800mg/d和>800mg/d分为Ca1、Ca2和Ca3三组,采用协方差分析校正年龄、身高、体重、雌激素和蛋白质摄入量后比较三种钙摄入水平对骨密度的影响。结果显示,TBBMC、TBBMD、FNBMD、WSBMD、LSBMD均随钙摄入量的增加而增加,三种钙摄入水平间的差异具有统计学意义(P<0.05)。钙摄入量>800mg/d组女童的TBBMC、TBBMD及各部位BMD均显著高于<500mg/d组,各部位BMD也均显著高于500-800mg/d组(P<0.05)。骨代谢相关生化指标中,骨形成指标—血清OC随钙摄入量的增加而增加,骨吸收指标—尿Dpd/cr随钙摄入量的增加而降低。
4.四个多态性位点各基因型女童骨密度的比较采用协方差分析校正年龄、身高、体重、雌激素和钙摄入量后比较各位点多态性对骨密度的影响。结果显示,仅有OPG基因T950C多态性位点三种基因型之间女童的TBBMC、TBBMD、FNBMD、WSBMD均存在显著差异(P<0.05),并呈现出CC>TC>TT的趋势。CC基因型者TBBMC、TBBMD、FNBMD和WSBMD显著高于TT、TC基因型者(P<0.05),但TT和TC基因型比较,TBBMC、TBBMD、FNBMD和WSBMD未见显著差异(P>0.05)。而三种基因型女童的LSBMD之间未发现显著差异(P>0.05)。OPG基因T245G、A163G多态性位点和COL1A2基因各基因型女童TBBMC、TBBMD、FNBMD、WSBMD和LSBMD均未发现有显著差异(P>0.05)。
5.两种基因及基因与钙摄入量对女童骨密度的交互作用经双因素协方差方法校正年龄、身高和体重后,所选取的7对因素(COL1A2*OPGT950C,COL1A2*OPGT245G,COL1A2*OPGA163G,COL1A2*Ca,OPGT950C*Ca,OPGT245G*Ca,OPGA163G*Ca)中,仅发现OPG基因T950C位点与钙摄入水平对WSBMD存在交互作用(P<0.05)。
以基因型对女童进行分组,分别比较不同钙摄入水平对每组女童的WSBMD影响时发现,对于TT基因型女童,Ca1组的WSBMD较Ca2、Ca3组分别低13.0%、23.7%,差异显著(P<0.05)。而TC、CC基因型女童的WSBMD在不同钙摄入水平间均无统计学意义(P>0.05)。再以钙摄入水平对女童进行分组,分别比较不同基因型对女童WSBMD的影响时发现,钙摄入量<500mg/d时,CC基因型女童的WSBMD较TT和TC基因型分别高19%、11.2%,差异有显著意义(P<0.01)。当钙摄入量增加到500mg/d以上时,三种基因型女童的WSBMD均未见显著差异。表明OPG基因T950C多态性对WSBMD的影响仅在低钙摄入(<500mg/d)时才具有显著意义,表现为CC基因型女童的WSBMD显著高于TT和TC基因型个体。
结论:1.健康青春前期女童OPG基因的三个多态性位点基因型分布频率为:T950C:TT-41.1%,TC-50.5%,CC-8.4%;T245G:TT-77.1%,TG-21.5%,GG-1.4%;A163G:AA-74.8%,AG-21.5%,GG-3.7%;COL1A2位点基因分布频率为:mm-73.4%,Mm-24.3%,MM-2.3%。
2.OPG基因T950C位点多态性对女童TBBMD、FNBMD、WSBMD有显著影响,CC基因型个体具有较高的骨密度,而TC+TT基因型个体的骨密度较低。该位点多态性可能是青春前期女童低骨量者筛选的一个有价值的遗传学标志。
3.在本研究涉及的钙摄入量范围内,青春前期健康女童TBBMC、TBBMD、FNBMD、WSBMD、LSBMD均随钙摄入量增加而增加,钙摄入量>800mg/d的女童,其FNBMD、WSBMD、LSBMD均显著高于未达到800mg/d的女童。
4.钙摄入量与OPG基因T950C位点基因型对青春前期女童WSBMD存在显著交互作用,在低钙摄入(<500mg/d)时,CC基因型个体的WSBMD显著高于TC、TT基因型个体。