经鼻入脑转运通路(即鼻-脑通路),是利用人体正常生理状态下鼻与脑解剖学特性之间的联系,为预防和治疗脑部疾病的药物提供的一条由鼻腔给药而在中枢神经系统中发挥作用的传递途径。利用鼻-脑通路输送药物的给药形式,具有有效提高药物生物利用度、使药物具有良好的脑部靶向性、快速发挥药物疗效、对机体无侵害性损伤、使用方便等特点,近年来受到广泛关注,而依据鼻-脑通路理论设计的鼻腔给药系统及制剂也已成为现代药剂学研究领域中的新热点。但是在使用鼻腔给药制剂后,常会出现脑内药物浓度测定值较低、靶向性不足的现象,这主要是由于鼻-脑通路涉及复杂的生理过程,并受药物自身诸多理化性质的影响所造成的。因此为了有效提高药物经鼻给药后的脑部生物利用度,对药物鼻-脑转运过程中,机体与药物间产生相互作用的机制进行研究,显得尤为重要。鼻-脑通路的药物转运形式包括绕过血脑屏障将药物由鼻腔直接运送至中枢神经系统的直接通路,和药物先经鼻腔内毛细血管吸收入血进入体循环后再透过血脑屏障抵达脑部的间接通路,并且二者往往同时发挥作用,但是,无论何种鼻-脑通路形式,药物都需要首先通过鼻黏膜屏障,才能进一步转运,抵达病灶,发挥疗效。目前对于鼻-脑通路药物递送的基础研究主要集中于对药物的脑部靶向性、入脑效率、血脑屏障透过能力进行评价和探讨,而对鼻黏膜渗透这一重要过程的研究相对较少,已有的相关研究也多采用大型哺乳动物离体鼻黏膜组织为模型,进行药物单一的渗透能力考察,限于离体组织活性较低,无法对药物与鼻黏膜间相互作用及影响机制进行深入挖掘。本课题组前期通过原代培养,构建人源鼻黏膜上皮细胞模型作为体外鼻黏膜细胞模型,对芳香开窍类药物的黏膜渗透增强作用进行相关研究,取得一定研究成果,但由于人源细胞来源有限,且取材多来自病变组织,故所构建细胞模型存在些许不足,并且对于鼻-脑通路的整体过程的探讨未能涉及,故认为有待于对研究进一步完善和补充。通窍散瘀方源自临床经验方,由葛根、白芍、薄荷等药物组成,具有散瘀活血、醒脑通窍等作用,用于治疗脑卒中等脑部疾病。本课题组选择实验常用动物大鼠作为鼻黏膜组织取材对象,利用细胞原代培养技术,作为原代鼻黏膜细胞模型,同时培养人肺腺癌细胞系Calu-3细胞,作为模拟体外鼻黏膜人源细胞模型,两者共同应用,全面地从原代和人源两种细胞模型角度对通窍散瘀方中主要药效成分葛根素、芍药苷、薄荷脑的鼻黏膜的吸收情况和药物配伍的黏膜渗透促进机制进行研究。并且借助细胞共培养技术,将Calu-3细胞与能够良好模拟血脑屏障的MDCK-MDRl细胞共同培养,用以构建完整地模拟鼻-脑间接通路的体外模型,对药物在整体的经鼻入脑转运过程中的传递情况进行详尽分析,期望对鼻-脑通路和鼻腔给药系统有更加深入的了解和认识。1鼠原代鼻黏膜上皮细胞体外模型、人Calu-3细胞模型的构建和鼻-脑间接通路共培养模型的构建本研究通过对大鼠鼻中隔上覆盖的鼻黏膜组织进行取材,采用蛋白酶消化法、细胞筛分选法分离、收集鼠鼻黏膜上皮细胞(rat nasal epithelial cell,RNEC),利用差速贴壁法去除成纤维细胞、内皮细胞等杂质细胞达到细胞纯化目的后,使用DMEM培养基(含10%胎牛血清、1%双抗)在饱和湿度、37℃、5%CO2条件下,培养24h,促使细胞贴壁生长,随后去除旧培养基,使用含有细胞生长添加因子的无血清BEGM培养基继续培养,可培养出形态良好、生长稳定的原代细胞。利用nti-pan Cytokeratin抗体(角蛋白PCK抗体)对细胞进行荧光标记,经免疫荧光化学反应鉴定,于激光共聚焦显微镜下观察,所培养的原代细胞PCK抗体染色呈阳性,证实培养出的细胞为鼻粘膜上皮细胞,且纯度较高。同时,在原代细胞培养过程中,考察不同种类的培养基(包括BEGM培养基、BEGM:DMEM/F12(1:1)培养基、DMEM培养基、含10%FBS的DMEM培养基、DMEM/F12培养基、含10%FBS的DMEM/F12培养基),对细胞生长的影响,发现使用无血清类培养基更适于原代细胞体外培养,其中使用BEGM培养基培养出的细胞,透明度高,折光性强,形态均一,呈铺路石状,可达到满意的培养效果。人肺腺癌细胞系(Calu-3细胞),作为体外模拟鼻黏膜的人源细胞模型,其培养过程属于常规细胞系培养操作,将细胞以含10%FBS、1%双抗、1NEAA的MEM培养基制成细胞悬液后,接种于培养瓶内,饱和湿度、37℃、5%CO2条件下的培养箱中,连续培养,隔天换液,5天左右之后细胞可生长至与鼻黏膜原代细胞形态相似、连接紧密、折光度高的融合状态。两种细胞模型的构建形式操作简便、重复性好,通过绘制细胞生长曲线,发现生长周期相对较短,均可稳定传代培养,通过冻存可有效保持细胞生理状态,复苏后细胞活力良好,并且在细胞成膜性和标准药物透过性能上,均表现出良好的模型特性,为后续药物在鼻黏膜吸收情况和作用机制的体外研究奠定坚实基础。为了能够将鼻-脑间接通路转运过程中,鼻黏膜屏障和血脑屏障这两道关键生理阻碍,紧密地联系在一起,真实反映体内生理情况,在体外构建合理的研究模型,本实验充分利用Transwell细胞培养板组件和细胞共培养技术,结合体内生理结构特性,选择模拟鼻黏膜屏障的Calu-3细胞和血脑屏障的MDCK-MDR1细胞进行间接共培养,首次构建出新颖的模拟鼻-脑间接通路的体外共培养细胞模型。通过显微镜下观察和电阻值测定,发现在共培养体系中,两种模拟不同组织结构的细胞均能够稳定生长,形成紧密单层膜结构,可用于药物在鼻-脑间接通路中连续转运过程中吸收、渗透情况的研究。2通窍散瘀方中主要有效成分的细胞毒性研究由于体外细胞模型的特殊性,在研究药物转运及配伍机制作用前,需要先对药物的细胞毒性进行考察,以确定各细胞模型中适宜的给药剂量,同时可以为后续鼻腔给药制剂的安全、合理的给药剂量提供依据。研究采用MTT比色法,对不同浓度药物和配伍在RNEC细胞和Calu-3细胞中的毒性进行考察。结果表明各个药物的细胞毒性均与给药剂量存在相关性,随着给药浓度升高细胞毒性作用也不断增强；RNEC细胞中,薄荷脑浓度在0～50μg/mL,芍药苷浓度在0-200μg/mL,葛根素浓度在0～300μg/mL,葛根素与芍药苷配伍(按组方比例1：0.4)浓度在0～100μg/mL(以芍药苷计),葛根素与薄荷脑配伍(按组方比例1：0.5)浓度在0～50μg/mL(以薄荷脑计),三者共同配伍(按组方比例1：0.4：0.5)浓度在0～50μg/mL范围内(以薄荷脑计),对细胞不产生毒性作用；Calu-3细胞中,薄荷脑浓度在0～60μg/ mL,芍药苷浓度在0～300μg/mL,葛根素浓度在0～350μgmL,葛根素与芍药苷配伍(按组方比例1：0.4)浓度在0～1OOμg/mL(以芍药苷计),葛根素与薄荷脑配伍(按组方比例1：0.5)浓度在0～60μg/mL(以薄荷脑计),三者共同配伍(按组方比例1：0.4：0.5)浓度在0～60μg/mL范围内(以薄荷脑计),对细胞不产生毒性作用；三种药物相比较,薄荷脑最大给药量最小,其细胞毒性最大,芍药苷次之,而葛根素的细胞毒性最小；与RNEC细胞毒性相比,Calu-3细胞中同种药物或配伍所产生毒性范围较大,可说明Calu-3细胞相应药物耐受强度较RNEC细胞稍强。3通窍散瘀方中主要有效成分黏膜细胞模型转运实验研究本研究分别将培养出的RNEC细胞和Calu-3细胞接种于Transwe 11细胞培养板的聚碳酸酯膜上,以气-液界面培养条件形成的细胞单层膜结构,模拟鼻腔黏膜,随后对通窍散瘀方中主要药效成分的转运进行研究,以评价药物的鼻黏膜渗透情况及组方配伍后对吸收的影响。对不同浓度的葛根素在RNEC细胞和Calu-3细胞单层膜模型中转运研究发现,药物的吸收、外排速率(dQ/dt)均随浓度升高而增大,不同浓度组间表观渗透系数(Papp)值无显著差异,药物外排率(ER)均在1左右,说明葛根素的黏膜转运在研究浓度范围内以被动扩散为主。葛根素配伍不同浓度的芍药苷时,其转运研究结果显示,与无配伍的葛根素转运相比较,葛根素渗透能力并未显著改变,提示组方过程中,芍药苷并不能促进葛根素的鼻黏膜吸收,而主要作为药效成分发挥治疗作用。当配伍中含有薄荷脑时,葛根素在两种细胞模型转运的表观渗透系数,与无配伍的葛根素转运相比较,均显著升高(P<0.05),表明借助薄荷脑渗透增强的作用,葛根素的鼻黏膜吸收可被显著增强,有利于提高葛根素鼻-脑通路转运过程中药物的生物利用度。4通窍散瘀方中主要有效成分鼻-脑间接通路共培养细胞模型中转运实验研究在构建Calu-3细胞与MDCK-MDRl细胞共培养模型的基础上,不同浓度的葛根素以及配伍芍药苷和薄荷脑,在鼻-脑间接通路转运过程中的情况进行研究,考察药物连续通过两侧细胞屏障过程中渗透能力,评价配伍药物对葛根转运能力和配伍渗透增强作用的影响。发现与单层细胞模型转运研究结果相似,葛根素在转运过程中以被动扩散为主,配伍薄荷脑达到一定浓度可有效促进其渗透,而配伍芍药苷未能促进。然而,在共培养模型中,由于多重因素影响,葛根素连续透过两层细胞屏障难度较大,在透过第一层后,难于再透过第二层被检查。研究中,仅在高浓度葛根素条件下,当配伍薄荷脑浓度达到60μg/mL时,葛根素在通过第二层细胞后可被检测到。为了详细对薄荷脑渗透促进能力进行阐述,在保证薄荷脑渗透作用的情况下,对不同浓度葛根素共培养转运情况进行深入研究,按照研究所采用的检测方法,证明了60gg/mL的薄荷脑在体外共培养模型中,可对100μg/ nL以上的葛根素起到显著地连续促进双层细胞屏障的渗透作用。由此可见,共培养模型转运研究结果一方面表明连续转运过程需要较高的药物浓度为保障,另一方面也体现了薄荷脑连续的渗透增强能力。5通窍散瘀方中主要有效成分的细胞转运作用机理研究药物在鼻黏膜上皮细胞的转运过程为多种形式的综合作用,因此本课题选择多种与细胞模型转运和体内相关生理指标对葛根素转运过程及组方配伍可能涉及到的影响因素进行分析。跨膜电阻值(TEER)常用于表征细胞单层膜结构中细胞间的疏密程度,本研究对葛根素、芍药苷、薄荷脑对细胞TEER值的影响进行考察。在使用电阻仪对给药后细胞的跨膜电阻值变化测定的研究中发现,两种细胞模型的TEER值均在配伍薄荷脑后显著下降,提示薄荷脑促进葛根素黏膜渗透的作用与其使单层细胞膜结构疏松、增强药物细胞旁路转运密切相关。鼻黏膜细胞的紧密连接(tight junction, TJ)结构是限制药物摄入的主要屏障,TJ结构主要由多种紧密连接蛋白(tight junction proteins)构成,因此本课题通过研究药物对两种细胞模型中的Occludin、Claudin-1、ZO-1、F-actin四种紧密连接蛋白的作用,、进一步从黏膜紧密程度影响的方面对药物的作用进行评价,采用免疫荧光染色方法,通过激光共聚焦显微镜观察及对荧光强度的分析,发现薄荷脑对此四种紧密连接蛋白均有一定程度的抑制作用,从而打开紧密连接结构,削弱紧密连接的屏障作用,促进药物的鼻粘膜渗透性。黏膜上皮细胞常表达的P糖蛋白,影响药物的透过,课题组采用流式细胞仪,对给药后细胞罗丹明123摄入所产生的荧光强度进行分析,与典型的P糖蛋白抑制剂维拉帕米对比,发现葛根素、芍药苷、薄荷脑均与P糖蛋白存在相互作用,在配伍应用的过程中,理论上存在竞争抑制作用,可促使葛根素透过增多。细胞膜流动性强弱同样同样影响着药物转运的程度,本课题采用荧光漂白恢复技术(FRAP),观测药物作用对细胞膜中荧光标记物迁移特性的影响,绘制荧光恢复曲线、计算荧光恢复率,发现薄荷脑达到一定浓度时,细胞荧光恢复率可显著升高,说明薄荷脑能够作用于细胞膜的磷脂双分子层,增加膜脂流动性,降低膜粘度,利于药物跨膜转运。此外,因为药物综合转运过程常与酶介导的代谢活动相关,故本研究通过考察药物对Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的影响,阐释药物单独使用及配伍使用在细胞模型转运过程中离子通道和能量代谢的相关情况,发现葛根素、芍药苷、薄荷脑三种药物成分,对于Na+-K+-ATP酶的能量代谢无显著影响,而对于Ca2+-ATP酶,薄荷脑可显著增强其活性,这不仅说明薄荷脑对于Ca2+-ATP酶的活性进行调控,同时由于紧密连接蛋白的表达抑制,同样与钙离子流动有关,进而阐释了薄荷脑对紧密连接蛋白调控的可能机制。