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猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS）又称猪喘气病、猪地方流行性肺炎,是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）感染引起的一种慢性、高度接触性、以咳嗽和喘气为主要症状的传染病。该病广泛分布于世界各地,流行率高达38%-100%。目前主要采取灭活疫苗免疫的方式防控。ELISA方法是临床应用最广泛的Mhp抗体检测方法,但现有的商品化IgG ELISA检测试剂盒不能区分灭活疫苗产生的抗体和自然感染产生抗体。Mhp366蛋白是一个Mhp膜表面脂蛋白,编码蛋白具有良好的抗原性。但该蛋白在体外培养的Mhp中表达量极低,不能刺激机体产生体液免疫应答;在自然感染猪的Mhp中刺激机体产生高水平的体液免疫应答。本研究拟建立区分Mhp高免血清抗体与恢复期血清抗体鉴别诊断ELISA方法和Mhp阴性血清与恢复期血清鉴别诊断ELISA方法。1.Mhp366-N蛋白的原核表达与纯化目的:原核表达纯化Mhp366-N蛋白;方法:用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,以pGEX-6P-1-mhp366重组质粒为模板,扩增含有能区分灭活疫苗抗体和和自然感染抗体的Mhp366蛋白68-88位氨基酸(68QKENSQKNDVVNSQNKTEKTE88)区段的1-837位核苷酸序列,连接原核表达载体pET28a（+）,转化到BL21（DE3）中,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,再用Ni2+亲和层析柱纯化,得到高纯度的Mhp366蛋白。结果:重组Mhp366-N蛋白能以可溶和包涵体两种形式表达,可溶Mhp366-N蛋白的表达量可达到整个菌体蛋白的5%;经Ni2+亲和层析柱纯化后纯度超过90%。结论:为后续ELISA检测方法的建立提供了高纯度的Mhp366-N蛋白。2.猪肺炎支原体高免血清抗体与恢复期血清抗体鉴别诊断ELISA方法的建立目的:建立Mhp高免血清抗体与恢复期血清抗体鉴别诊断ELISA方法。方法:确定Mhp高免血清抗体与恢复期血清抗体鉴别诊断ELISA方法的最佳反应条件,包括最佳抗原包被浓度、最佳封闭液、最佳封闭时间、最佳血清稀释度、最佳血清孵育时间、最佳二抗稀释浓度、最佳二抗孵育时间、最佳显色时间。确定了判定标准,进行了批内重复试验、批间重复试验、特异性和灵敏性检验。最后进行了临床样品检测,并与其他试剂盒的结果进行了比较。结果:确定抗原的最佳包被浓度为0.25μg/mL,最佳封闭液为2.5%脱脂奶粉,最佳封闭时间为0.5 h,最佳血清稀释度为1:1 000,最佳血清孵育时间为0.5 h,最佳二抗工作浓度为1:10 000,最佳二抗孵育时间为2 h,最佳显色时间为10 min。确定临界值为0.319。批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于7%。该方法具有良好的特异性和灵敏性。结论:建立了Mhp高免血清抗体与恢复期血清抗体鉴别诊断ELISA方法。3.猪肺炎支原体阴性血清与恢复期血清鉴别诊断ELISA方法的建立目的:建立Mhp阴性血清与恢复期血清鉴别诊断ELISA方法。方法:确定Mhp阴性血清与恢复期血清鉴别诊断ELISA方法的最佳反应条件,包括最佳抗原包被浓度、最佳封闭液、最佳封闭时间、最佳血清稀释度、最佳血清孵育时间、最佳二抗稀释浓度、最佳二抗孵育时间、最佳显色时间。确定了判定标准,进行了批内重复试验、批间重复试验、特异性和灵敏性检验。最后进行了临床样品检测,并与其他试剂盒的结果进行了比较。结果:确定抗原的最佳包被浓度为0.25μg/mL,最佳封闭液为2.5%脱脂奶粉,最佳封闭时间为1 h,最佳血清稀释度为1:500,最佳血清孵育时间为0.5 h,最佳二抗工作浓度为1:10 000,最佳二抗孵育时间为2h,最佳显色时间为15 min。确定临界值为0.297。批内重复试验的变异系数小于8%,批间重复试验的变异系数小于6%。该方法具有良好的特异性和灵敏性。结论:建立的了Mhp阴性血清与恢复期血清鉴别诊断ELISA方法。