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背景T细胞免疫球蛋白黏附分子-3（T-cell immunoglobulin and Mucin-domain containing-3,Tim-3）是一种广泛表达于多种细胞表面的,具有多种调节功能的免疫分子。Tim-3表达于Th1、CD8+T细胞、Th17、Treg、单核巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、神经小胶质细胞和内皮细胞等。Tim-3参与感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥等多种病理过程。另外,研究结果显示,缺血后处理可以通过抑制Tim-3信号通路减少梗塞发生。肢体远程处理同样可以通过影响Tim-3信号通路的传递,发挥减少脑损伤的作用。多项研究提示,Tim-3可能在多种心脑血管疾病的病理过程中发挥免疫调节功能。心血管疾病的发生与内皮细胞功能失调有关,而内皮细胞功能失调与一氧化氮（NO）介导的血管扩张有着密切的关系。一氧化氮合酶（NOS）家族在血管生理学机制中发挥重要作用,并且参与了多种病理过程。NOS有三种的亚型:神经型（nNOS）、内皮细胞型（eNOS）、诱导型（iNOS）,其中nNOS和eNOS持续性表达。eNOS是调节血管功能的主要NOS异构体,物理和化学刺激作用能够激发或者增强它的催化活性,由nNOS催化产生的NO主要功能是调节神经兴奋性、突触可塑性的势差现象或抑制作用,参与记忆和学习过程。nNOS同时也表达于心肌细胞、骨骼肌细胞、血管内测平滑肌和内皮细胞、阴茎动脉外膜和肾脏致密斑细胞。iNOS的诱导表达与感染和炎症反应有关,是防御应答的一部分,但是iNOS在生理条件的表达水平下很低。iNOS在炎性细胞因子的刺激作用下表达水平上升后,它产生的NO水平是eNOS的100到1000倍。过量的NO可能对血管平滑肌细胞发挥有害作用。iNOS来源的NO对心肌细胞有毒性作用。血管平滑肌细胞上的iNOS,是脓毒血症休克时低血压的主要原因。Tim-3是否能够调控内皮细胞上iNOS的表达,从而参与动脉粥样硬化这一心血管疾病的病理过程?针对这个问题,目前未见报道。目的通过观察Tim-3对血管内皮细胞系Ea.hy 926合成NO的影响,初步探究Tim-3在动脉粥样硬化病理过程中的作用。我们希望本研究的成果,能够为动脉粥样硬化疾病的诊断和治疗,提供一定的理论基础。方法1.通过RANi技术构建稳定低表达Tim-3血管内皮细胞系Ea.hy926,使用流式细胞术和RT-qPCR方法,从蛋白表达水平和mRNA水平鉴定细胞是否构建成功。2.转染重组质粒,构建稳定高表达Tim-3 Ea.hy 926细胞系,并使用流式细胞术和RT-qPCR方法,从蛋白和mRNA两方面鉴定细胞是否构建成功。3.用Tim-3融合蛋白（Tim-3 Fc）阻断Ea.hy926细胞系上Tim-3信号通路,同时用LPS刺激该细胞,RT-qPCR法检测刺激细胞的iNOS mRNA表达水平,并通过Griess法检测细胞培养上清中亚硝酸盐水平。4.LPS刺激Tim-3不同表达水平的Ea.hy926细胞系,RT-qPCR法检测刺激细胞的iNOS mRNA表达水平,并通过Griess法检测细胞培养上清中亚硝酸盐水平。结果1.流式细胞术和RT-qPCR实验结果证明,成功构建稳定低表达Tim-3 Ea.hy 926细胞系。2.流式细胞术和RT-qPCR实验结果证明,成功构建稳定高表达Tim-3 Ea.hy 926细胞系。3.LPS刺激后,阻断Tim-3信号通路的Ea.hy 926细胞系iNOS mRNA表达水平降低,细胞培养基中亚硝酸盐水平降低。4.LPS刺激后,相对于对照组,Tim-3低表达的Ea.hy 926细胞系iNOS mRNA的表达水平较低,细胞培养基中亚硝酸盐水平相对较低。5.LPS刺激后,Tim-3高表达的Ea.hy 926细胞系,iNOS mRNA表达水平相对较高,细胞培养基中亚硝酸盐水平相对较高。结论Tim-3信号通路能够影响内皮细胞合成iNOS和释放NO。