【摘 要】
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尽管反义核酸、Ribozyme、DNA enzyme以及双链RNA干涉小分子与mRNA分子在一级结构上严格按Watson-Crick碱基匹配原则互补配对发挥作用,然而能有效结合发挥作用的却是那些接近
【出 处】
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中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 解放军军事医学科学院
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尽管反义核酸、Ribozyme、DNA enzyme以及双链RNA干涉小分子与mRNA分子在一级结构上严格按Watson-Crick碱基匹配原则互补配对发挥作用,然而能有效结合发挥作用的却是那些接近mRNA分子高度折叠结构的"靶点"的反义序列.该工作的主要目标是建立mRNA靶点的筛选方法,运用反义设计技术进行基因治疗和基因功能研究.首先,采用单链寡核苷酸随机序列文库,首次应用3末端固定方法使mRNA在液相中的自然状态下与其进行杂交,通过洗脱、筛选,获得mRNA的结合文库序列,阐明mRNA全部结构靶点,建立了一种新的mRNA靶点筛选的分子生物学方法RASS(RNA accessible sites screening).其次,用RASS方法和文献报道的MAST(mRNA accessible sites tagging)技术同时对模型基因-绿色荧光蛋白GFP的mRNA进行了靶点筛选,应用RASS获得GFP mRNA上3个结合靶点1,2,4,采用MAST方法获得了1,2,3和4等4个靶点.第三,将RASS方法和MAST方法、计算机软件RNAstructure3.71模拟方法对GFP的靶点,MAST方法和RNAstructure3.71模拟方法对小鼠Fas基因,兔β-globin基因片段的靶点进行了比较.第四,由于RASS和MAST方法在应用中,需要一条一条地测定成百条序列,1次测序反应获得1条文库小片段序列,测定过程繁杂,消耗大量人力和物力,不利于其在普通实验室推广应用.该研究自行建立了两个专利方法,其一采用小序列酶切、连接、克隆测序,其二通过设计搭桥引物、扩增达到连接而完成连接测序的目的.文库小片段序列通过连接进行测序,1次测序反应可以获得8至20条文库小片段序列,其费用约为原始方法的二十分之一至八分之一.此方法快速而经济,能满足普通实验室应用RASS,MAST筛选靶点的需求.
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