研究背景脓毒症是由各种感染因素导致的机体全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),是重症监护病房(intensive care unit,ICU)中最常见的疾病之一。脓毒症常导致患者出现休克进而造成多器官功能衰竭,而肾脏是其损伤常见的靶器官。脓毒症和肾损伤间关系密切,ICU中约有30%-50%的脓毒症患者出现急性肾损伤(acute kidney injury,AKI),新出现急性肾损伤的患者一半以上也是由脓毒症所引起。尽管近些年脓毒症急性肾损伤早期诊断和治疗技术的不断发展,目前仍缺乏有效的方法来预防和治疗脓毒症急性肾损伤。脓毒症一旦出现急性肾损伤会进一步增加患者的死亡率。国内外的研究表明其死亡率维持在50-70%左右[1,2]。急性肾损伤给患者造成巨大的经济负担。中国AKI患者的平均花费为5071美元[3],而国外的数据表明急性肾损伤的患者每例额外增加住院费用7933美元,需要透析患者每例额外增加42077美元[4]。脓毒症急性肾损伤的高死亡率与其发病机制不明确紧密相关。脓毒症急性肾损伤的发病机制复杂,一系列的病理过程参与了脓毒症急性肾损伤的发病,包括肾脏血流动力学紊乱、内皮和上皮细胞坏死、肾小管内血栓形成以及过度的免疫和炎症反应等[5,6]。既往认为脓毒症急性肾损伤的主要发病机制为休克、肾脏低灌注导致的肾小管上皮细胞坏死。但目前的研究发现肾小管坏死的程度同肾功能的损害程度并不平行,一些严重的脓毒症急性肾损伤患者肾组织活检并未发现显著的肾小管坏死,提示存在其它类型的发病机制参与急性肾脏损伤的发生[7,8]。缺血、低灌注、外源性毒素以及内源性细胞因子等因素触发的肾脏细胞凋亡可能参急性肾损伤的病理生理过程。研究表明肾脏细胞凋亡可能在脓毒症急性肾损伤中起着重要的作用[7]。脓毒症急性肾损伤发病机制复杂,一系列的细胞因子参与了脓毒症急性肾损伤的发病。目前临床上常用的诊断脓毒症急性肾损伤的指标为血肌酐和尿量。除此之外,一些新的指标包括NGAL,KIM-1,IL-18,胱抑素C等也被应用于肾损伤的早期诊断[9-14]。乳脂球表皮生长因子-8(milk fat globule-EGF factor 8,MFG-E8)最早是从哺乳动物的乳腺组织中分离出来的一种亲脂性糖蛋白,是哺乳动物乳汁脂肪球膜的主要组成部分。MFG-E8是凋亡细胞清除过程中重要的桥梁分子,能够促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞。证据表明MFG-E8具有促进血管新生,维持肠道上皮细胞完整,调节炎症反应等重要作用[15]。由于MFG-E8在凋亡细胞清除中的重要作用使其参与了肺损伤、肝损伤、肠道炎性疾病、阿尔滋海默、痴呆、脑缺血再灌注损伤等疾病过程的发生与发展[1522]。MFG-E8在脓毒症的发病过程中也有着重要的作用。在大鼠脓毒症模型20小时后,MFG-E8蛋白表达含量下降(脾细胞表达下降48%,肝细胞表达下降70%,血浆表达下降45%)。LPS处理巨噬细胞使其MFG-E8蛋白表达下降。动物体内注射LPS可剂量相关地减少脾脏MFG-E8 mRNA表达,表明MFG-E8在脓毒症中的表达下降。但目前MFG-E8在脓毒症急性肾损伤中作用的研究有限[23]。本研究主要探讨MFG-E8在脓毒症急性肾脏损伤中的作用及其发挥作用的机制。通过盲肠结扎及穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)构建脓毒症急性肾损伤模型,采用分子生物学技术手段检测MFG-E8 mRNA和MFG-E8蛋白在脓毒症急性肾脏损伤中表达规律。研究外源性重组MFG-E8干预后脓毒症急性肾损伤模型中肾损伤标志物、肾脏组织病理学、凋亡相关蛋白表达变化来明确其是否对脓毒症急性肾损伤起保护作用及对肾脏细胞凋亡的影响。并且进一步探讨MFG-E8如何通过信号转导实现肾功能保护的目的。从而阐明MFG-E8在脓毒症急性肾损伤中作用的分子机制,为未来潜在的治疗方式做好理论基础。研究内容第一部分:脓毒症急性肾损伤小鼠模型的构建及肾脏细胞乳脂球表皮生长因子8的表达目的:构建小鼠脓毒症急性肾损伤模型,并通过RT-PCR、western blot等分子生物学方法检测MFG-E8在脓毒症急性肾损伤小鼠肾脏细胞中随时间表达变化的特点,为进一步的干预研究创建理论基础。方法:68只8-10周的SPF级雄性C57BL/6小鼠,随机分成3组。1.对照组(Control组):16只,空白对照;2.假手术组(Sham组):20只,仅行开腹手术,不进行盲肠结扎穿孔术;3.盲肠结扎穿孔组(CLP组):32只。依照Daniel Rittirsch方法行盲肠结扎穿孔术。采用结扎1/2长度位置处盲肠,21G针头盲肠穿刺两个孔方案。三组各取10只小鼠在造模后设置Oh、6h、12h、24h四个时间点采血检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平,收集尿液检测NGAL、KIM-1水平。CLP组另取16只小鼠,在Oh、6h、12h、24h四个时间点各处死4只取肾组织。采用RT-PCR及western blot方法测定肾组织中MFG-E8表达。剩下每组余6只小鼠进行行为学观察及生存分析。对于计量资料的统计学分析以均数土标准差(X±S)表示,组间的比较使用单因素方差分析,Kaplan-Meier法计算累计生存率及绘制生存曲线。p<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1.各组血清肌酐、尿素氮比较各时间节点假手术组血肌酐值与同期对照组相比差异无统计学意义(p>0.05)。CLP组在结扎穿孔术后血清肌酐呈现进行性上升。术后6小时血清肌酐升高,与Sham组相比差异具有统计学意义(p<0.01)。CLP组血清肌酐在结扎穿孔后12小时与初始0小时相比有显著性差异(p<0.01),肌酐增高超过基线水平1.5倍,可诊断急性肾损伤。假手术组在各时间点血清尿素氮与同期对照组相比,差异无统计学意义(p>0.05)。CLP术后6h小鼠血清尿素氮水平升高,术后12小时、24小时持续升高,同假手术组相比差异具有统计学意义(p<0.01)。2.尿 NGAL、KIM-1 比较假手术组尿NAGL、KIM-1水平与对照组相比,差异无统计学意义(p>0.05)。CLP组术后6小时尿NAGL、KIM-1升高,与假手术组相比有差异具有统计学意义(p<0.01),同样提示CLP组急性肾损伤的发生。3.小鼠肾脏病理及病理评分比较假手术组和对照组小鼠的肾脏组织病理未见明显异常,肾脏组织结构正常、清晰。CLP组小鼠出现肾脏损伤表现,肾损伤以肾小管病变为显著。表现为肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性。半定量分析发现CLP组术后肾脏病理评分显著增高。4.一般状态对照组及假手术组复苏迅速。复苏后活动灵活,可自由进食。CLP组苏醒延迟。复苏后表现异常,出现竖毛、寒战、气促及倦怠。生存分析发现,对照组及假手术组4天、7天无死亡,生存率100%。CLP组4天、7天生存率分别为66.6%和33.3%,差异具有统计学意义。5.MFG-E8 表达假手术组同正常对照组比较,肾组织MFG-E8 mRNA及MFG-E8蛋白表达水平差异无统计学意义。同正常对照组比较,CLP组肾脏MFG-E8 mRNA及蛋白表达水平在术后24小时显著下降(p<0.01)。CLP组随时间的延长,MFG-E8蛋白呈现时间依赖性下降。结论:1.CLP组小鼠出现血清肌酐、BUN水平明显增高,尿NGAL、KIM-1水平显著增高,出现脓毒症急性肾损伤表现。肾组织病理改变符合脓毒症急性肾损伤表现,肾脏病理评分显著增高。本部分研究表明术后24小时可作为取材时间点。2.通过控制手术方案,选择恰当C57BL/6小鼠可稳定复制脓毒症急性肾损伤模型。3.脓毒症急性肾损伤肾脏组织MFG-E8 mRNA及MFG-E8蛋白表达水平均下降。MFG-E8蛋白表现时间依赖性下降。4.肾脏MFG-E8的下降为进一步给予外源性rmMFG-E8干预创建理论基础。第二部分:重组小鼠乳脂球表皮生长因子-8对脓毒症急性肾损伤小鼠肾功能保护及对炎症指标影响的研究目的:构建脓毒症急性肾损伤模型,研究外源性乳脂球表皮生长因子-8对脓毒症急性肾损伤小鼠肾功能影响及其对炎症指标的影响。方法:SPF级雄性C57BL/6小鼠128只,随机分为8组。1.对照组(Control)组:16只,空白对照组;2.假手术组(Sham组):16只,仅行开腹手术,不进行盲肠结扎穿孔术;3.盲肠结扎穿孔组(CLP组):16只,行盲肠结扎穿孔术;4.盲肠结扎穿孔+PBS组(CLP+PBS组):16只,行盲肠结扎穿孔,术后腹腔注射rmMFG-E8溶解剂PBS 0.1ml;5.CLP+rmMFG-E8(5μg/kg)组:16只,行盲肠结扎穿孔术后腹腔注射 5μg/kg 的 rmMFG-E8;6.CLP+rmMFG-E8(10μg/kg)组:16 只,行盲肠结扎穿孔术后腹腔注射 10μg/kg 的 rmMFG-E8;7.CLP+rmMFG-E8(20μg/kg)组:16只,行盲肠结扎穿孔术后腹腔注射20μg/kg的rmMFG-E8;8.CLP+rmMFG-E8(40μg/kg)组:16只,行盲肠结扎穿孔术后腹腔注射40μg/kg的rmMFG-E8。根据第一部分结果,选择术后24小时为造模终点,每组取10只小鼠,留取血液及肾脏标本,抽血检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN),尿NGAL,尿KIM-1。肾组织行PAS染色,并进行肾损伤病理评分。余每组6只小鼠使用Kaplan-Meier法行生存分析,采用log-rank检验。p<0.05认为差异有统计学意义。结果:1.同对照组相比,脓毒症急性肾损伤组小鼠肾脏病理评分显著增加(p>0.01);同脓毒症组相比,CLP+rmMFG-E8组小鼠肾脏病理评分显著下降(p<0.01)。2.肾损伤指标方面,同对照组相比,脓毒症急性肾损伤组小鼠血肌酐、BUN水平显著增高(p<0.01)。同脓毒症组相比,各CLP+rmMFG-E8组剂量依赖性降低血肌酐、BUN水平。同对照组相比,脓毒症急性肾损伤组小鼠尿NGAL、KIM-1表达水平显著增加(p<0.01),同脓毒症组相比,CLP+rmMFG-E8能够剂量依赖性降低 NGAL、KIM-1 水平。3.血清检测炎症指标,同对照组相比,脓毒症组肾损伤小鼠肾脏组织IL-1,IL-6,TNF-α表达水平显著增加(p<0.01),同脓毒症组相比,各CLP+rmMFG-E8组小鼠肾脏组织IL-1,IL-6,TNF-α表达水平显著减少。4.同对照组相比,脓毒症急性肾损伤组小鼠肾脏组织IL-1,IL-6,TNF-αmRNA表达水平显著增加(p<0.01),同脓毒症组相比,各CLP+rmMFG-E8组小鼠肾脏组织IL-1,IL-6,TNF-αmRNA表达显著减少。5.假手术组和对照组小鼠全部存活。CLP造模组小鼠的生存率为33.33%。予rmMFG-E8能够剂量依赖性改善生存。5μg/kg rmMFG-E8小鼠生存率为33.33%,10μg/kg rmMFG-E8 组小鼠生存率为 40%,20μg/kg rmMFG-E8 小鼠生存率为 66.7%,10μg/kg rmMFG-E8组小鼠生存率为66.7%,rmMFG-E8尽管能提高生存率,但差异尚无统计学意义。结论:1.外源性MFG-E8能够改善脓毒症急性肾损伤病理评分,降低血清及尿液肾损伤标记物水平。2.外源性MFG-E8能够下调血中IL-1,IL-6,TNF-α及小鼠肾脏组织中IL-1,IL-6,TNF-αmRNA水平,降低脓毒症急性肾损伤小鼠炎症反应水平。3.外源性MFG-E8能改善小鼠死亡率。4.20μg/kg和40μg/k剂量的rmMFG-E8对肾脏具有类似的保护作用。可选用20μg/kg剂量的rmMFG-E8行进一步研究。第三部分:重组小鼠乳脂球表皮生长因子8对脓毒症急性肾损伤小鼠肾脏保护作用的机制研究目的:探讨重组小鼠乳脂球表皮生长因子8对脓毒症急性肾损伤小鼠肾脏细胞凋亡的影响,并探讨重组小鼠乳脂球表皮生长因子8对脓毒症急性肾损伤小鼠肾脏NF-κB信号转导通路的影响。旨在发现乳重组小鼠脂球表皮生长因子-8在脓毒症急性肾损伤保护的潜在机制。方法:同第一二部分。结果:1.重组乳脂球表皮生长因子-8对脓毒症肾损肾组织凋亡的影响同对照组及假手术相比较,CLP组cleavedcaspase-3蛋白在肾组织中表达显著上升(p<0.05),rmMFG-E8干预后可使肾组织cleavedcaspase-3水平降低(p<0.05)。与对照组相及假手术比较,CLP组Bax蛋白在肾组织中表达显著上升(p<0.05),rmMFG-E8干预后可使肾组织Bax水平降低(p<0.05)。与对照组相比较,CLP组Bcl-2蛋白在肾组织中表达显著降低(p<0.05),CLP+rmMFG-E8组可使肾组织Bax蛋白水平上升(p<0.05)。RT-PCR检测肾组织中Bax及Bcl-2的mRNA检测发现相同趋势。2.同对照组及假手术组比较,CLP组肾组织磷酸化p65,IκBα蛋白表达显著增多,细胞核中p65增多明显,提示NF-κB处于激活状态。rmMFG-E8组同CLP组比较,磷酸化p65,IIκBα表达降低,细胞核中p65减少。结果提示rmMFG-E8组减弱NF-κB细胞通路活化状态,从而改善脓毒症急性肾损伤。结论:1.在脓毒症中小鼠肾脏组织中cleaved caspase-3、Bax蛋白表达增高、凋亡细胞增加。重组小鼠乳脂球表皮生长因子-8能够降低减少cleaved caspase-3、Bax蛋白水平,减少肾脏细胞凋亡,减轻脓毒症急性肾损伤的程度。2.脓毒症小鼠肾脏组织中NF-κB p65呈高磷酸化水平,NF-κB信号通路表现为激活状态。重组小鼠乳脂球表皮生长因子-8能够抑制NF-κB的激活,从而减轻脓毒症急性肾损伤的程度。提示MFG-E8通过NF-κB信号转导途径改善脓毒症急性肾损伤。