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纤维素(Cellulose)是生物界含量最丰富的可再生性碳源[1]。纤维素酶(Cellulase)是能将纤维素转化为葡萄糖的一系列酶的总称。纤维素酶在降解利用纤维素作为能源物质的过程中起到关键性的作用,因此对纤维素酶的深入研究不仅可以丰富酶学研究的理论基础,还具有巨大的应用价值。从福寿螺(Ampullaria crossean)胃液中分离纯化得到一种分子量为41.5KDa的多功能纤维素酶,称为EGX,具有水解对-硝基酚纤维二糖苷(pNPC)、微晶纤维素(Sigmacell)、羧甲基纤维素(CMC-Na)、Birchwood的可溶性木聚糖(soluble xylan prepared from xylan from birchwood)以及Oat spelt的木聚糖(xylan from oat spelt)等5种底物的能力,即该酶是一种具有外切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶和内切-β-1,4-木聚糖酶三种活力的多功能纤维素酶。根据EGX氨基酸的核心序列从福寿螺基因组中克隆得到纤维酶基因egxa,长1.68Kb,结构分析表明由该基因编码的蛋白序列EGXA具有明显的催化结构域CD-A和结合结构域CBM-A。昆虫细胞杆状病毒表达系统具有安全性高,对外源基因克隆容量大,具有完善的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点,现已成为基因工程的四大表达系统(即杆状病毒、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。昆虫细胞在进化上与福寿螺相对而言比较接近,同时具有相似的蛋白表达加工系统,以及较强的表达和分泌系统,是真核基因重组表达及性质研究的良好载体。本实验分别将EGXA的全长基因egxa,催化结构域基因cd-a以及结合结构域基因cbm-a在昆虫细胞中表达,结果发现重组EGXA具有多种纤维素酶活力,且催化活性与野生型酶相当接近,即重组EGXA同样具有外切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶和内切-β-1,4-木聚糖酶三种活力。荧光酰肼标记染色发现,胞外分泌表达的EGXA被糖基化修饰,推测糖基化可能对EGXA的酶活具有重要贡献。独立表达的结合结构域CBM-A具有结合纤维素大分子不溶性底物sigmacell的能力。而重组表达的独立催化结构域CD-A则没有纤维素水解活力,或者说活力很低,以至于检测不到。我们成功地将福寿螺内源性纤维素酶基因egxa在真核表达系统——昆虫细胞杆状病毒表达系统中实现表达,这对动物纤维素酶研究来说是个重要的突破和补充。可喜的是重组EGXA具有的催化活力与野生型酶极其相似,可以作为动物纤维素酶研究的重要参考,也可以作为高活力纤维素酶改造的重要依据。单纯的结合结构域CBM-A也已得到表达,并且具有结合纤维素底物的活力。接下来我们将继续通过重组表达或者用蛋白酶切的方法获得有活力的结合结构域,以研究EGXA两个结构域之间的相互作用关系,还将在质谱方法的帮助下找出糖基化的位点及类型,并利用定点突变等手段研究糖基化对酶活力的影响。