很长时期以来,人们都认为成年哺乳动物的心肌是终末分化组织,没有再生能力,当炎症、缺血等原因损害心脏时,受损的心肌组织只能通过疤痕、肥大等方式代偿。新近的研究认为,虽然成年心脏中大部分心肌细胞永久地退出了细胞循环,但是心脏组织中有心肌干细胞(cardiac stem cells, CSCs)存在,心肌细胞可以被CSCs更新,心脏是具有内在自我更新潜能的器官。这一发现为临床干细胞疗法治疗某些心脏疾病开辟了崭新的思路。本研究试图建立一种稳定方便的分离和培养CSCs方法,然后对其生长、分化及电生理特性进行研究,观察CSCs向心肌样细胞、窦房结样细胞分化的可能性,以期为将来进一步探讨该定向分化的机制和临床干细胞治疗窦房结功能不全提供基础理论依据。整个研究分为三部分：第一部分心肌干细胞的培养、分离、纯化和鉴定目的：建立稳定的分离和培养心肌干细胞(CSCs)方法,以及观察CSCs的生物学特性。方法：无菌操作取下1月龄SD大鼠心脏,经PBS液反复冲洗后,剪成小碎块,然后进行消化,过程如下：根据组织块的量加入0.1%Ⅱ型胶原酶溶液2～3ml,37℃振荡消化5分钟,吸管弃去消化液,然后加入0.2%胰蛋白酶溶液2～3ml,37℃再振荡消化5分钟,吸管弃去消化液。如此重复3次。将所得残余组织块进行培养。观察、收集从培养组织块中爬出的细胞。以c-kit为标记物,先用流式细胞仪对培养细胞进行c-kit阳性率检测,然后用该标记物进行细胞分选。之后鉴定分选后细胞的表型,观察分选后细胞生长、增殖特性。同时比较不同种属、同一心脏不同部位、不同性别c-kit+纯化细胞的增殖能力。结果：消化后的心肌组织块经培养后,可出现小圆形、亮的细胞。这些小圆、亮的细胞多附着在成纤维细胞之上,或者在成纤维细胞周围,而没有成纤维细胞的区域则小圆亮的细胞很少。不是所有组织块周围均有小圆、亮的细胞出现,也不是所有成纤维细胞附近都有小圆亮的细胞爬出。有些小细胞在从组织块边缘爬出来的同时便开始增殖、簇集成小细胞团。收集这些细胞并选用流式细胞仪进行c-kit+分选。流式细胞仪分选结果显示,送检单细胞悬液的c-kit阳性率为22.89%。将分选后细胞置于生长培养基中继续培养,先用台盼蓝检测细胞活力,结果显示所有检测细胞的活力均大于99.5%。同时流式细胞仪检测显示c-kit+细胞的CD34和CD45表达阴性。这些细胞可以呈对称和不对称方式增殖,可以呈葡萄状成簇(cluster)生长,增殖并形成心球样细胞团结构(cardiosphere)。对称方式增殖的c-kit+细胞具有生长相对稳定、扩增能力较弱的特性,而不对称方式增殖的c-kit+细胞具有较强的扩增能力,容易簇集成团。之后用上述的方法提取、观察兔、犬和人的c-kit+纯化细胞。比较显示,不同种属c-kit+纯化细胞的增殖能力差异较大,其中犬的增殖能力最强,其次是兔、大鼠,而人的c-kit+纯化细胞的增殖能力最差。选取等量来源于同一犬心脏不同部位的c-kit+纯化细胞,比较其增殖能力,结果显示来源于心尖部位心肌组织的分选细胞增殖速度最快,而来源于心脏中部(包括心房下部和心室上部)心肌的分选细胞增殖速度最慢,来源于心房肌的分选细胞增殖速度介于前两者之间。在相差显微镜的帮助下,共有180个分选后c-kit+细胞被分别单个地放在96孔培养板中。5天后,大约有70%的细胞存活并且开始缓慢增殖,这些存活细胞中的约40%细胞开始簇集成小球团状细胞。结论：本方法可以对不同种属心肌组织中c-kit+细胞进行成功的分离和体外培养。可以认为分选后c-kit+纯化细胞就是表达c-kit阳性的心肌干细胞(CSCs),这些CSCs的表型为c-kit+CD34-CD45-。在培养条件下短期内可获得大量CSCs,可以满足进一步观察CSCs定向分化和研究其电生理特性的需要。第二部分C-kit+心肌干细胞的分化标记物鉴定和电生理检测目的：拟通过我们自己改进的培养方法,进一步探讨心肌干细胞增殖的特性和分化谱系；研究c-kit+CSCs的电生理特性；探讨c-kit+CSCs经过培养一段时间后分化为心肌细胞和窦房结细胞的可能性。方法：将分选后纯化的犬c-kit+细胞继续培养、扩增。分别在培养的第2、4、8周时,在培养皿中制备细胞爬片,然后用免疫荧光方法观察c-kit+细胞分化谱系的标记物表达,不同分化谱系的标记物分别是：①心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin I, cTnI),是心肌细胞谱系分化标记物；②平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin, SMA),是平滑肌细胞谱系分化标记物；③CD31,是内皮细胞谱系分化标记物。之后用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测不同时期的目标基因mRNA表达,包括GATA-4、HCN2和HCN4。同时采用全细胞膜片钳技术及记录系统,对未分化的c-kit+CSCs进行膜电流检测。结果：第2周时,采用免疫荧光染色的检测方法,观察到细胞的分裂,同时可以看到有些正在分裂细胞的cTnⅠ染色呈阳性,提示在分裂增殖的同时就可以开始细胞的分化。在第4周时,培养细胞表达cTnⅠ、SMA、CD31的阳性率分别是10.5±4.2%、13.5±5.1%和12.9±3.5%。在第8周时上述表达均有增加,培养细胞表达cTnⅠ、SMA、CD31的阳性率分别是23.2±3.6%、25.9±6.6%和28.3±6.1%,各标记物在不同时期阳性率差异分别均有显著统计学意义,P<0.05。经过4、8周培养的细胞中有GATA-4、HCN2和HCN4表达,且8周细胞的GATA-4、HCN2、HCN4的表达均分别高于培养4周的细胞,差异有显著统计学意义,P<0.05。对分选后尚未分化的c-kit+细胞进行膜电流检测,先检测Na+电流,可以检测到很低的电流。然后检测Ca2+电流,此时无明显电流出现,然而将细胞外液换成10mM BaCl2,则可以记录到较明显电流。该电流在-35mV时发生,20-30mV时达到高峰,最强电流是30mv时达-60.5±4.8 pA。结论：在培养条件下,c-kit+CSCs能够分化为心肌样细胞和窦房结样细胞,在未分化c-kit+CSCs的细胞膜上可以记录到多种内向电流,说明该干细胞的细胞膜上存在可以介导内向电流的离子通道蛋白,提示c-kit+CSCs有成为生物起搏“种子细胞”的潜力,将来可以在体内实验中进一步观察分化情况。第三部分5-氮杂胞苷诱导大鼠心肌干细胞的分化为窦房结样细胞的研究目的：尽管CSCs可以分化为窦房结样细胞,但是在一般培养条件下该定向分化的效率还比较低。只有提高该分化的效率,才有利于进一步研究其分化的分子调控机制,才有利于进一步探讨其临床价值。为了提高定向分化为窦房结样细胞的效率,初步探讨其分化的机制,选择5-氮杂胞苷(5-Aazacytidine,5-Aza)诱导作用CSCs,观察其生长、分化结果。方法：将大鼠的CSCs接种到6孔培养板上进行培养。分别用含有5、10、15μmol/L 5-氮杂胞苷诱导培养24h。然后观察不同浓度5-Aza对CSCs生长的影响,检测诱导后c-kit+CSCs分化谱系的标记物表达,用RT-PCR方法检测GATA-4、HCN2和HCN4的mRNA表达。最后选择膜片钳技术及记录系统,对未分化的c-kit+CSCs进行膜电流检测。结果：与对照组比较,各诱导组均有较多细胞死亡、溶解。5-Aza浓度越高,细胞生长越慢,增殖速度越慢。诱导后3天,出现较多的小圆球形细胞贴壁生长,培养一周后,一些细胞的体积增大,并向四周延伸,形成梭状形态。免疫荧光检测显示,经过0、5 and 10μM 5-Aza诱导后培养8周的细胞表达cTnl的阳性率分别是18.7±4.3%、19.2±7.2%和32.6±8.5%；表达GATA-4的阳性率分别是21.4±8.1%、22.6±3.4%和31.4±2.6%; 10μM 5-Aza诱导后的培养细胞表达cTnl和GATA-4的阳性率最高,P<0.05,同时表达HCN4的阳性率为11.7±4.2%。对未分化CSCs的膜电流检测显示,未检测到Na+电流,检测Ca2+电流时有很低的电流出现,再次将细胞外液换成10mMBaCl2,则可以记录到较强电流。该电流在-40mV时发生,10-20mV时达到高峰,最强电流是10mv时达-61.5±2.8 pA。在诱导后第28～33天,培养细胞中出现了2个轻微搏动的细胞。高倍显微镜下仔细观察,在底部快铺满细胞的培养皿中可见略呈纺锤形的分化细胞在低幅度的搏动,搏动频率为35～65次/分。搏动持续时间不足24小时。结论：10μM 5-Aza联合一定浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)有增强CSCs分化为心肌样细胞和窦房结样细胞的作用。尽管10μmol/L 5-Aza对CSCs的生长有一定的毒副作用,但存活下来的细胞分化效率更高,分化为窦房结样细胞的阳性率也增高,极少量培养细胞在一段时期后还出现了微弱的搏动。该浓度(10μM)的5-Aza对未分化CSCs的细胞膜离子通道蛋白的表达没有明显抑制作用。说明10μM 5-Aza比较适合作为诱导CSCs的常用诱导剂。不过,诱导结果表明所观察的三个细胞谱系的分化效率都比对照组高,这说明在诱导后的两个月内该诱导剂的作用效果主要是把CSCs全面分化的潜力发挥了出来,至少在观察的8周时间内没有明显体现出特异的主要向心肌细胞和窦房结细胞分化的潜力。