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副溶血性弧菌是一种广泛分布于近岸海水、海底沉积物和海产品中的嗜盐性细菌,也是引起我国特别是沿海地区细菌性食物中毒危害的首要食源性致病菌。近年来,有关副溶血性弧菌的食物中毒事件频频发生,引起人们普遍关注。传统的副溶血性弧菌检测方法操作繁琐,时间较长,不能满足食品中致病菌快速、灵敏检测的需要。因此需要建立快速、灵敏的副溶血性弧菌检验方法。本研究应用双重PCR技术快速检测新鲜海水贝类样品中副溶血性弧菌。按照副溶血性弧菌(tdh基因)及(tl基因)设计两对引物,对影响PCR的主要因素(模板量、退火温度和引物浓度)进行优化,确定双重PCR最佳反应体系及检测条件。最佳扩增体系为:反应总体积为 20μL,l uLDNA 模板,4,uLdNTP(2.5mmol/L)、0.2μL Taq 酶(2.5 U/μL)、2μL 1O×Buffer缓冲液(含Mg2+)、两对2.5mmol/L的上下游引物各0.2μL,用灭菌超纯水补齐。最佳反应条件为:采用热启动,预变性94℃ 4min,变性94℃ 1min,退火温度56℃ 1min,延伸72℃ 2min,30个循环,终延伸72℃ 7min。该方法最低检出限为2.5 × 102cfu/mL,模拟污染样品的检测限为10cfu/g。采用国家标准GB 4789.7-2013对PCR结果进行验证,结果表明:两种检测方法的结果完全一致。对市场随机抽取的77份新鲜红螺样品、63份方形马珂蛤样品和61份菲律宾蛤仔应用本研究所建立的双重PCR法进行检测,8h内快速检出PCR阳性样品分别为15份、8份和5份,春夏两个季节里红螺中副溶血性弧菌的检出率分别为13.3%和25%,方形马珂蛤为6.7%和21.2%,菲律宾蛤仔为0%和16.1%。本研究能较快速检验海水贝类中的副溶血性弧菌,与国标中使用的检测方法相比可大大缩短检测时间,具备较高的灵敏度和准确性。