第一部分：基于人脐静脉内皮细胞的体外三维新生血管模型的构建 目的：建立基于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、纤维蛋白基质及微载体的体外三维新生血管模型，并建立体外三维新生血管模型的定量分析方法。 方法：应用胰蛋白酶消化的方法，从新生儿脐带分离HUVEC，传代纯化并建立稳定的培养体系，用纯化及稳定培养的HUVEC构建体外三维新生血管模型。1．HUVEC单层细胞三维培养：以1％人纤维蛋白原溶液经凝血酶诱导聚合后作为模型基质，将HUVEC单层细胞接种于纤维蛋白基质中，持续培养5天。2．基于微载体的三维模型：将HUVEC包被微载体，培养至细胞汇合度达100％，然后将包被有HUVEC的微载体接种于1％人纤维蛋白基质中，持续培养5天。3．连续培养期间每天随机照相，通过测量每个微载体上毛细血管样结构的平均长度(ALS)进行定量分析。 结果：分离纯化的HUVEC经免疫组化鉴定纯度接近100％，能稳定传代培养10代以上；三维培养过程中观察到HVEC伸展、出芽、分枝到毛细血管样网状结构形成等特征性的血管新生过程，通过测定微载体上的ALS可绘制出类似细胞生长曲线的新生血管生长曲线。 结论：成功获得了纯化的HUVEC并能稳定培养，同时建立了稳定的体外三维新生血管模型，能很好的模拟体内血管新生的特征性过程，并能进行血管新生的形态学及定量分析，为后续新生血管的相关研究建立了良好的技术平台。 第二部分：CD105基因在血管新生过程中的表达变化 目的：在体外三维新生血管模型的基础上，应用半定量RT—PCR技术研究HUVEC生长过程及血管新生过程中CD105基因的表达变化。 方法：1．MTT法绘制HUVEC生长曲线，根据生长曲线选择HUVEC生长的特征性时期(接种当天、缓慢生长期、快速增殖期及生长平台期)作为不同的检测点；2．构建基于微载体的三维新生血管模型，观察血管新生的特征性过程，选择模型构建的当天、出芽期、出芽分枝期及毛细血管样网状结构形成期为不同的检测点；3．应用TRIzol 法抽提二维培养HUVEC的总RNA(ttRNA)，应用改良硫氰酸胍法抽提三维模型中HUVEC的ttRNA；4．以管家基因GAPDH为内参，通过半定量RT—PCR检测、比较上述不同时间点CD105基因的表达情况。 结果：1．细胞生长曲线显示，HUVEC接种后第一天生长缓慢，第三天快速增殖，到第五天细胞基本铺满瓶底，进入生长平台期；2．三维模型构建后第一天即见有HUVEC向基质中伸展迁移(出芽)，第三天时“出芽”更明显，并出现明显的分枝状结构，第五天时芽状结构相互连接，形成复杂的毛细血管样网络结构；3．半定量RT—PCR检测显示，二维培养的HUVEC在快速增殖期CD105基因的表达明显上调，而在缓慢生长及生长平台期表达较弱；三维模型中，在血管新生的出芽分枝期CD105基因表达明显上调，而在出芽早期及分枝连成网状结构后表达明显降低。 结论：CD105基因在HUVEC的生长及血管新生的过程中均有特征性的表达变化，表现为在HUVEC快速增殖及新生血管出芽分枝等活跃期表达明显上调，而在相对静止的时期表达较弱，提示CD105基因的表达可能在血管内皮细胞的增殖、新生血管的形成过程中起着较为重要的作用。 第三部分：干预CD105基因的表达对血管新生的影响 目的：应用反义寡核苷酸(ASODN)技术及基因转染技术，观察干预血管内皮细胞CD105基因的表达对血管新生的影响，研究分析CD105基因在血管新生过程中的作用，为基于CD105的基因靶向治疗的深入研究进行初步探索。 方法：1．针对人CD105基因的启动子序列设计ASODN序列，将ASODN序列随机重排作为随机对照寡核苷酸(SCODN)，序列合成并硫代磷酸化修饰后，应用脂质体转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，设立空白对照及SCODN对照；RT—PCR及流式细胞仪检测各组转染后CD105的表达情况；应用MTT法检测转染后HUVEC的生长变化，并用转染后的HUVEC构建三维新生血管模型，进行形态学分析及定量分析。2．应用降落PCR获得带酶切位点的CD105基因的全长开放阅读框(ORF)，通过酶切、T4连接构建真核表达的重组质粒pcDNA3.1(—)—CD105，经测序验证后应用脂质体转染人脐静脉内皮细胞株ECV304，设立空白对照及空载质粒对照；RT—PCR．及流式细胞仪检测各组转染后CD105的表达情况；应用MTT法检测转染后ECV304的生长变化，并用转染后的ECV304构建三维新生血管模型，进行形态学分析及定量分析。 结果：1．HUVEC转染ASODN后，RT-PCR．检测显示CD105基因的表达明显被抑制，流式细胞仪检测显示CD105的表达率从99.97％降到48.24％，并能维持低表达5天以上，而SCODN及空白对照组CD105的表达无明显变化；CD105的表达被抑制后，HUVEC的生长及血管新生过程均受到明显影响。2．ECV304转染重组质粒后，RT-PCR检测显示CD105基因的表达明显上调，流式细胞仪检测显示CD105的表达率从21.81％上升至54.21％，并能维持高表达5天以上，而空载质粒及空白对照组CD105的表达无明显变化；形态学及定量分析均显示，重组质粒、空载质粒及空白对照组ECV304的生长及血管新生过程均未见有明显差异。 结论：CD105基因的表达在HVEC的增殖、新生血管的形成过程中起着极为重要的作用，是一个理想的新生血管标志物，抑制CD105基因的表达能明显抑制新生血管的形成；血管内皮细胞的增殖及血管的新生过程必定伴有CD105的高表达，但CD105基因的过度表达与血管的新生状态无明显的相关性，CD105在评估血管新生及促血管新生的作用方面可能存在着一个阈值，超过阈值的CD105表达可能在血管新生方面无实际意义；CD105在血管新生的诊断及抗血管新生的靶向治疗方面均有极具潜力的发展前景，而CD105在血管内皮细胞上表达所起的作用可能较为复杂，确切的功能研究还有待于进一步的深入。 第四部分：CD105在肝细胞性肝癌新生血管中的表达及其临床意义 目的：应用免疫组织化学方法检测原发性肝细胞性肝癌(HCC)中CD105、CD34以及VEGF的表达情况，并与HCC的临床病理资料进行相关性分析，研究CD105在HCC中表达的临床意义。 方法：收集在南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科手术治疗的原发性肝癌患者105例，手术切除的标本常规石蜡切片，分别行HE染色及CD105、CD34免疫组织化学染色；HE染色切片根据国际抗癌联盟(UICC)2002年颁布的肝癌分期标准进行病理分析，并选定特征性的位点构建组织芯片；组织芯片分别行CD105及VEGF免疫组织化学染色； CD105及CD34免疫组织化学染色的常规切片进行微血管密度(MVD)计数，分别称为MVD—CD105、MVD—CD34；组织芯片行CD105染色后计数MVD(MVD—MA)，VEGF染色检测其表达强度；应用统计学分析软件进行MVD—CD105、MVD—CD34、MVD—MA、VEGF表达强度以及HCC临床病理资料的相关性分析。 结果：1．CD105、CD34在所有的HCC病例中均有阳性表达，能将HCC肿瘤组织内的微血管特异性的显色。2．MVD—CD105平均值为141.0±55.0，MVD—CD34平均值为241.4±103.6，MVD—CD34明显高于MVD—CD105(p＜0.001)，但两者存在显著的正相关(r=0.774，p＜0.001)；MVD—MA平均值为57.2±37.6，其单位面积的MVD值明显低于MVD—CD105，但是两者仍呈显著正相关(r=0.741，p＜0.001)。3．MVD—CD105和MVD—MA都和VEGF的表达强度呈正相关，但是MVD—CD105比MVD—MA的相关性更显著(r=0.254，p=0.009和r=0.219，p=0.025)，而MVD—CD34和VEGF表达强度无明显相关性(r=0.167，p=0.088)。4．小肝癌组(直径≤5cm)的MVD—CD105和MVD—MA都显著高于大肝癌组(直径＞5 cm)(p=0.001和p=0.043)，而有静脉侵犯组的MVD—CD105和MVD—CD34都明显低于无静脉侵犯组(p＜0.001和P＜0.001)；只有MVD—CD105和TNM分期相关，其中分期高的病例MVD明显低于分期低的(Ⅰ&Ⅱ期与Ⅲ期相比，p=0.011)。5．以MVD的中位值为界将患者分为两组进行比较，高MVD—CD105组的预后明显比低MVD—CD105组差(p=0.009)，而CD34标记的MVD以及组织芯片上计数的MVD则与预后无明显相关(p=0.052和p=0.712)；在大肝癌组中高MVD—CD105与预后差相关(p=0.012)，而在小肝癌组中MVD—CD105与预后无明显相关性(p=0.184)。 结论：CD105能将HCC肿瘤组织中的微血管特异性地显色，并且CD105是比CD34更理想的HCC新生血管标志物，可用于HCC新生血管的诊断及靶向治疗；血管新生分析可能只在肿瘤发展过程中MVD相对较低的时期才是理想的独立预后指标；组织芯片技术虽然在评估肿瘤细胞的免疫组化标志物的研究中得到广泛的应用，但是并不适合HCC新生血管的评估分析。