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研究目的:子宫内膜异位症(EM)是子宫内膜腺体和间质种植于子宫以外的雌激素依赖性疾病。EM的发病率在育龄期妇女中约为10％-15％。目前EM主要的药物治疗方法是通过降低循环雌激素水平抑制异位内膜生长达到治疗的目的。但长期应用有因雌激素水平减低引起的骨质疏松等副作用。实验及临床研究证明葛根素(Puerarin)是具有弱雌激素效应的植物雌激素，能够竞争性结合异位内膜的雌激素受体(ER)起到拮抗雌激素的作用，达到治疗EM的目的，同时研究发现一定治疗剂量的葛根素并不会导致骨质疏松。本研究的目的拟通过体外实验进一步观察葛根素在雌激素环境中对MC3T3-E1小鼠成骨细胞生物功能的影响，并从非基因组及基因组效应角度探索葛根素影响成骨细胞代谢的作用通路。 研究方法: 1.体外培养MC3T3-E1成骨细胞，应用MTT法观察不同剂量葛根素、雌二醇（E2）及二者联合时对MC3T3-E1增殖能力的影响;Real time PCR法检测不同浓度葛根素、E2及二者联合时对细胞碱性磷酸酶（ALP）、RANKL(Ligand of receptor activator of NF-KB Ligand)和OPG(Osteoprotegerin)基因表达的影响。 2.采用RNA干扰技术，敲除雌激素膜受体GPR30，观察阻断不同雌激素核受体亚型对葛根素及E2促MC3T3-E1增殖作用的影响;使用Realtime PCR法检测分别阻断核受体及膜受体后葛根素、E2对细胞RANKL及OPG基因表达的影响;观察阻断不同雌激素核受体亚型对葛根素、E2及两者合用对细胞RANKL及OPG基因表达的影响。 3.通过免疫共沉淀法检测葛根素、E2及两者联合对雌激素受体对共调节蛋白募集的影响。 研究结果: 1.10-7mol/L浓度的葛根素可显著促进MC3T3-E1增殖，但对ALP基因的表达无明显影响;除外10-8mol/L浓度葛根素，其他浓度葛根素对E2促MC3T3-E1增殖无明显影响。葛根素在特定浓度范围可影响ALP、RANKL基因的表达，对OPG基因表达有促进趋势。一定浓度的葛根素可增强E2对RANKL mRNA表达的抑制作用。 2.沉默GPR30基因表达后，ERα inhibitor能够显著阻断E2和葛根素对MC3T3-E1的促增殖作用，ERβ inhibitor不能阻断E2和葛根素对MC3T3-E1的促增殖作用。 3.E2及葛根素均能够抑制RANKL基因的表达，促进OPG基因表达。沉默雌激素膜受体GPR30后，E2和葛根素抑制RANKL基因表达作用愈加明显，而对OPG mRNA表达的上调作用则被逆转。ICI182780可轻度减弱葛根素对OPG mRNA表达的促进作用。 4.ICI182780及ERβ inhibitor对E2抑制RANKL基因表达的作用无明显影响，加入ERα inhibitor后，E2对RANKL基因表达的抑制作用明显增强，而ERα及ERβinhibitor均能够抑制E2对OPG基因表达的上调趋势。加入ERβ inhibitor后，葛根素对RANKL的抑制作用被逆转，而ERα inhibitor对葛根素的作用无显著影响。 5.E2能显著增强ERα对共激活子的募集作用，而葛根素能够显著抑制E2对ERα共激活子的募集; E2能显著抑制ERα对共抑制子NcoR1的募集作用，联合应用葛根素后，对NcoR1的募集作用显著增强，减弱对共激活子的募集作用。 研究结论:一定浓度葛根素与E2均可刺激成骨细胞MC3T3-E1增殖，且一定浓度葛根素对E2调节MC3T3-E1增殖及RANKL、OPG基因表达具有不同程度的影响;葛根素与E2主要由ERα介导促增殖作用，由核受体介导调控RANKL的表达，其中ERα、ERβ通路作用相互拮抗;通过以GPR30为代表的雌激素膜受体调控OPG基因表达。 E2能够通过调节ERα相关共调节蛋白的募集作用促进成骨细胞增殖，葛根素则能增强E2的这一作用达到促进成骨的作用。