肺癌是当今世界发病率、死亡率最高的恶性肿瘤,而且呈现不断攀升的趋势,其5年生存率仅有15％左右。近年来,随着诊疗方法的进步,合理地综合应用现有的手术、放疗和化疗等几种治疗手段,肺癌的某些亚型治愈率已经有所提高,但总体疗效仍不理想。日益增加的肺癌患者人数和较低的治愈率已经成为当前困扰全世界医务工作者的难题。根据肺癌的组织学表现将其分为鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌、小细胞癌、大细胞癌等亚型,其中肺鳞癌约占所有原发性肺癌的35％～45％。　　 恶性肿瘤的生长、浸润和转移是一个复杂的生物学过程,包括癌基因的活化、瘤细胞凋亡与增殖失衡、瘤组织新生血管形成、瘤细胞脱落并侵入基质等步骤。在这一系列的过程中,各个步骤相互作用又相对独立,只要某一个步骤未独立完成,肿瘤的生长和侵袭就不能得以实现。　　 人参是一种五加科多年生草本植物,作为一种中药,在我国有几千年的应用历史。人参具有广泛的药用价值,其主要活性成分人参皂甙具有抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化等作用。目前从人参中分离提纯独立的人参皂甙成分并揭示其作用机制已经成为各国学者研究的热点。人参皂甙Rg3是人参皂甙的一种,已有研究表明Rg3具有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的浸润和转移、抑制肿瘤新生血管生成、逆转肿瘤细胞多药耐药性等多种抗肿瘤活性。因此,人参皂甙Rg3作为一种重要的肿瘤辅助治疗药物,具有广泛的临床应用前景。有关Rg3对肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖、凋亡、侵袭影响的研究,除本课题组前期发表的相关文章外,迄今国内外未见其他文献报道。　　 为深入探讨人参皂甙Rg3对肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖、凋亡、侵袭的影响,寻求除手术、放疗和化疗以外肺鳞癌有效的治疗方法,本研究首先采用MTT比色法、流式细胞仪、免疫细胞化学、原位杂交、RT-PCR、Western-blot等技术联合检测了人参皂甙Rg3在体外对肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖、凋亡的影响及对凋亡相关基因survivin、livin mRNA、蛋白质表达水平的影响,探讨了Rg3诱导SK-MES-1细胞凋亡的分子机制；进一步运用Boyden小室侵袭实验、RT-PCR、Western-blot、酶联免疫吸附试验、明胶酶谱法等技术检测了Rg3在体外对肺鳞癌SK-MES-1细胞侵袭及对基质金属蛋白酶表达的影响及其调控机制；最后在此基础上建立裸鼠移植瘤模型,采用TUNEL、原位杂交、免疫组化等技术检测了Rg3在动物模型体内对瘤细胞凋亡、增殖及survivin、livin表达的影响,并检测了Rg3在体内对基质金属蛋白酶及其调控分子CXCL12、CXCR4的影响,进一步阐明了Rg3诱导SK-MES-1细胞凋亡、抑制其侵袭的机制与下调survivin、livin及基质金属蛋白酶的表达密切相关。为探讨人参皂甙Rg3对肺鳞癌SK-MES-1细胞生物学行为的影响及其机制,为人参皂甙Rg3的临床应用提供进一步的理论基础,本研究分以下3个部分进行了系列研究。　　 第一部分人参皂甙Rg3对肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖、凋亡的影响　　 方法：　　 1.采用MTT法测定经5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L Rg3分别作用24h、48h、72h后SK-MES-1细胞增殖活性的改变,并于倒置显微镜下观察细胞形态变化。　　 2.采用流式细胞仪测定人参皂甙Rg3对SK-MES-1细胞凋亡的影响。　　 3.采用RT-PCR和原位杂交技术检测人参皂甙Rg3对SK-MES-1细胞survivin、livin mRNA表达的影响。　　 4.采用免疫细胞化学和Western-blot技术检测人参皂甙Rg3对SK-MES-1细胞survivin、livin蛋白表达的影响。　　 5.统计学处理:应用SPSS17.0软件处理,采用单因素方差分析和LSD多重比较法。检验水准α=0.05。　　 结果：　　 1.Rg3作用后细胞的增殖活性受到明显抑制,不同浓度组间(P<0.05)、不同时间组间(P<0.05)均存在显著性差异。Rg3作用48 h后细胞生长抑制率达最高水平。Rg3作用后细胞的形态发生改变,且随药物浓度增加而更为显著。　　 2.流式细胞术显示,随着Rg3浓度增加,细胞凋亡率逐渐增加,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。　　 3.RT-PCR和原位杂交联合检测结果显示,Rg3作用后,survivin和livinmRNA表达均受到抑制,随Rg3浓度增加,survivin和livin表达均逐渐降低,不同浓度组间差异有统计学意义(P<0.05)。　　 4.免疫细胞化学和Western-blot技术联合检测结果显示,Rg3作用后,survivin和livin蛋白表达均受到抑制,且具有一定的剂量依赖性,不同浓度组间差异有统计学意义(P<0.05)。　　 第二部分人参皂甙Rg3对肺鳞癌SK-MES一1细胞侵袭力的影响及其机制　　 方法：　　 1.采用Boyden chamber侵袭实验计算不同浓度Rg3作用后穿膜的SK-MES-1细胞数,以比较Rg3对细胞侵袭能力的影响。　　 2.采用明胶酶谱法检测Rg3对MMP-2,MMP-9活性的影响。　　 3.采用RT-PCR和Western-blot技术分别检测Rg3对SK-MES-1细胞MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达的影响。　　 4.采用ELISA法测定细胞培养上清中CXCL12、CXCR4水平。　　 5.采用RT-PCR和Western-blot技术分别检测Rg3对SK-MES-1细胞CXCL12、CXCR4 mRNA和蛋白表达的影响。　　 6.统计学处理:应用SPSS17.0软件处理,采用单因素方差分析和LSD多重比较法。检验水准α=0.05。　　 结果：　　 1.Boyden chamber体外侵袭实验结果显示,随着Rg3浓度增加,穿越Matrigel胶的SK-MES-1细胞数逐渐减少,不同浓度组间差异有统计学意义(P<0.05)。　　 2.明胶酶谱法显示,随着Rg3浓度增加,MMP-2和MMP-9酶活力逐渐降低,不同浓度组间差异有统计学意义(P<0.05)。　　 3.RT-PCR和Western-blot结果显示,随着Rg3浓度增加,MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达逐渐降低,不同浓度组间差异有统计学意义(P<0.05)。　　 4.ELISA法检测提示,经Rg3作用后,SK-MES-1细胞培养上清中的CXCL12、CXCR4含量显著降低,不同浓度组间差异有统计学意义(P<0.05)。　　 5.Rg3作用后,CXCL12和CXCR4 mRNA和蛋白表达降低,具有一定的剂量依赖性,不同浓度组间差异有统计学意义(P<0.05)。　　 第三部分人参皂甙Rg3对肺鳞癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其机制　　 方法：　　 1.建立裸鼠SK-MES-1细胞移植瘤模型,通过灌胃给予不同剂量的Rg3,比较各组裸鼠成瘤大小。　　 2.应用TUNEL法检测各组裸鼠肿瘤组织中SK-MES-1细胞凋亡情况。　　 3.采用原位杂交和免疫细胞化学技术分别检测各组裸鼠肿瘤组织中survivin、livin mRNA和蛋白的表达情况。　　 4.采用原位杂交和免疫细胞化学技术分别检测各组裸鼠肿瘤组织中MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表达情况。　　 5.采用原位杂交和免疫细胞化学技术分别检测各组裸鼠肿瘤组织中CXCL12、CXCR4 mRNA和蛋白的表达情况。　　 6.统计学处理:应用SPSS17.0软件处理,采用单因素方差分析和LSD多重比较法。检验水准α=0.05。　　 结果：　　 1.随着给予裸鼠的Rg3剂量增加,裸鼠移植瘤体积逐渐减小,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。　　 2.TUNEL法显示,随着给予裸鼠的Rg3剂量增加,瘤组织内SK-MES-1细胞凋亡率逐渐增加,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。　　 3.给予Rg3后,裸鼠瘤组织内survivin、livin mRNA和蛋白表达均降低,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。　　 4.随着给予裸鼠的Rg3剂量增加,裸鼠瘤组织内MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达均逐渐降低,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。　　 5.给予Rg3后,裸鼠瘤组织内CXCL12、CXCR4 mRNA和蛋白表达均降低,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。　　 结论：　　 1.人参皂甙Rg3能够抑制肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖并能够抑制SK-MES-1细胞移植瘤的生长。　　 2.人参皂甙Rg3在体外和动物模型体内具有诱导肺鳞癌SK-MES-1细胞凋亡的作用,其作用机制可能与下调凋亡基因survivin、livin在mRNA和蛋白水平的表达有关。　　 3.人参皂甙Rg3能够降低SK-MES-1细胞的侵袭能力,其作用机制可能与下调MMP-2、MMP-9在mRNA和蛋白水平的表达,降低MMP-2、MMP-9的酶活力有关。　　 4.人参皂甙Rg3对MMP-2、MMP-9表达的下调作用可能通过影响趋化因子CXCL12及其受体CXCR4的表达而实现。