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差异蛋白质组学研究中,蛋白质的酶解和标记是两个关键步骤,发展固载基质可再生的、固载量较大的以及酶活性较高的固定化酶,极大地缩短蛋白质样品的酶解和标记时间,对蛋白质组学的发展具有重要意义。论文采用原子转移自由基聚合反应(ATRP反应)将胰蛋白酶的核酸适配体接枝到硅胶颗粒表面,并以此作为酶固定化的介质,实现胰蛋白酶的固定化,进一步考察了酶的固载量以及酶解活性。以基于核酸适配体的固定酶为手段,采用18O标记定量的差异蛋白质组学分析方法,研究了环境污染物六溴环十二烷(HBCD)暴露前后的差异蛋白质,并与常规的溶液酶解手段所得的结果进行对比。所得的实验结果如下:首先,利用ATRP反应将胰蛋白酶的核酸适配体接枝到硅胶颗粒表面,利用核酸适配体与胰蛋白酶之间的高亲和性和高特异性相互作用,实现胰蛋白酶的固定化,实验测得其固载量为10.6μg胰蛋白酶/mg硅胶,相比于戊二醛交联方法所得到的胰酶固载量(3.1μg/mg)有了很大的提高。其次,以牛血清白蛋白(BSA)为底物,考察了基于ATRP反应的固定化胰酶的酶解活性以及日内和日间稳定性,并将其与基于戊二醛交联方法所得的固定化胰酶以及游离的胰酶进行了对比,结果表明,基于ATRP反应的固定化胰酶的酶解活性要高于基于戊二醛方法的固定化胰酶,即酶解得到的肽段数以及序列覆盖率都比后者高,达到了与游离胰酶相当的酶解水平,酶解肽段数为40左右,序列覆盖率为60%左右;并且在日内的5次酶解和日间的5次酶解都表现了较好的稳定性,酶解肽段数的相对标准偏差分别为28.82%和10.52%,序列覆盖率的相对标准偏差分别为20.13%和12.03%;再次,利用核酸在极端条件变性而温和条件下复性的特点,实现失活的固定化胰酶的洗脱及新胰酶的重新固载,其固载量为5.7μg/mg,虽然其固载量有所降低,但是其再生前后的固定胰酶酶解得到的酶解肽段数均在40条左右,得到的序列覆盖率均在56%左右,这说明基于核酸适配体的固载基质具有较好的再生性能。最后,以18O标记定量的差异蛋白质组学分析方法为研究手段,将基于核酸适配体的固定化酶用于环境污染物六溴环十二烷(HBCD)暴露的大鼠肝脏线粒体的差异蛋白质组学研究中。连续7天后腹腔注射HBCD后,与正常组对比,暴露大鼠的体重分析并没有表现出显著的统计学差异;基于核酸适配体的ATRP固定化胰酶对HBCD暴露大鼠的肝脏线粒体蛋白样品的18O的标记效率为85.97%,相对标记效率为91.26%,这与测序级游离胰酶得到的标记效果(标记效率为为90.30%,相对标记效率为95.97%)相当;经过SCX一维分离以及高效液相色谱质谱分析后,固定化胰酶组检索鉴定到245个蛋白,其中有36个差异蛋白,8个上调,28个下调;而测序级游离胰酶组共鉴定到了581个蛋白,有277个符合蛋白定量的要求,其中差异蛋白有64个,7个上调,57个下调;在对差异蛋白进行的GO分类以及Pathway分析中,两种胰酶得到了相似的蛋白质组学信息,大部分的差异表达蛋白都与代谢相关,涉及糖类、脂类以及氨基酸的代谢。值得指出的是,溶液的酶解和标记时间分别为16h和20h,而固定化酶对蛋白的酶解和标记时间均为1h,后者极大地缩短了整个操作时间,并且,固定化酶可以在很大程度上抑制回标反应。经过进一步的发展,基于核酸适配体的固定化酶或许可以发展为一种潜在的差异蛋白质组学研究中的酶解手段。