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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的猪的一种繁殖障碍和呼吸系统的高度接触性传染病。1996年,该病在我国首次被报道并成功分离出病毒。临床上,疫苗仍是防控PRRSV的主要措施之一。但传统的弱毒活疫苗存在一定的安全问题,且体液免疫产生的抗体与野毒感染产生的抗体不易区分,使得新型疫苗的研发迫在眉睫。单轮感染性PRRSV复制子疫苗（single-round infectious PRRSV replicon vaccine）产生的病毒能够感染易感细胞,但是病毒进入易感细胞后,不能进行细胞与细胞之间的传播,从而能够使自己机体产生免疫且具有安全性,还能够与野毒区分,作为一种潜在的新型疫苗无疑是未来PRRSV疫苗研究的一个方向。本研究拟单轮感染性PRRSV复制子疫苗进行初步的探索。这些缺失突变体很有可能在正常的细胞中不能进行体外拯救。但有研究发现,通过反向遗传学操作,对某些病毒基因进行缺失突变,其在正常细胞中不能拯救,但在相应互补蛋白表达的细胞中,可拯救出病毒,本研究的目的,是为了探讨这个反式互补系统能否用于PRRSV,作为一种潜在的新型疫苗。GP5、M、N蛋白是PRRSV的主要结构蛋白,都具有较强的免疫原性,可刺激机体产生PRRSV的主要抗体。我们首先构建了这三个结构蛋白的细胞系。根据PRRSV的全长感染性克隆pAJX25HB的基因序列,设计了扩增编码PRRSN GP5、M、N蛋白的三对特异性引物,以pAJX25HB质粒为模板,PCR扩增PRRSV ORF5、ORF6、ORF7基因,并插入到pLenti-CMV-GFP-Hypro载体,构建了重组质粒pLenti-CMV-GP5-Hypro、pLenti-CMV-M-Hypro、pLenti-CMV-N-Hypro。利用脂质体转染法将重组质粒pLenti-CMV-GP5/M/N-Hypro、包装质粒ps PAX2和外膜质粒VSVG共转染293T细胞,获得三株重组慢病毒。将重组慢病毒转导Marc-145细胞,利用潮霉素B加压筛选,获得三株分别稳定表达GP5、M、N蛋白的细胞系,命名为Marc-145-GP5、Marc-145-M、Marc-145-N细胞系。经过RT-PCR或IFA方法检测Marc-145-GP5、Marc-145-M和Marc-145-N细胞表达GP5、M和N的基因。结果表明我们成功构建稳定表达GP5、M和N蛋白的Marc-145细胞系。接着,在PRRSV全长感染性克隆pAJX25HB的基础上,通过融合PCR的方法,构建了PRRSV ORF5、ORF6、ORF7起始密码子（ATG）突变质粒（pAJX25HB-5tb、pAJX25HB-6tb、pAJX25HB-7tb）。将三个突变克隆分别转染相应的Marc-145-GP5、Marc-145-M和Marc-145-N细胞系和正常的Marc-145,并在相应的细胞系中连续传代。通过细胞病变、RT-PCR和IFA试验发现,PRRSV ORF5、ORF6起始密码子突变质粒不能在正常的Marc-145细胞中和相应的细胞中进行病毒体外拯救,说明GP5和M蛋白的功能不能通过反向互补的方式进行补偿。PRRSV ORF7起始密码子突变质粒也不能在Marc-145细胞上产生感染性的病毒粒子,但转染Marc-145-N细胞系能够拯救出病毒,但第三代病毒进行测序发现,突变的碱基恢复突变为原始的序列。pAJX25HB-7tb突变克隆能在细胞系中拯救但是传代病毒出现恢复突变。为此,我们进一步构建PRRSV N蛋白、N蛋白进行NRB区域（N端的RNA结合区域）、CDD区域（C端的二聚体化结构域）进行缺失,以及在N蛋白最N端、最C端和中间缺失6个氨基酸的突变克隆(pAJX25HB-63BS、pAJX25HB-63BS-CDD、pAJX25HB-63BS-NRB、pAJX25HB-63BS-N-6QSN、pAJX25HB-63BS-N-6QSC、pAJX25HB-63BS-N-6QSNC)。将这些突变克隆分别转染相应的Marc-145-N细胞系和正常的Marc-145,并在相应的细胞系中连续传代,均未能拯救出病毒,推测N蛋白编码区可能参与病毒的复制,从而影响病毒拯救。综上所述,本研究构建表达PRRSV主要结构蛋白的细胞系,并将其用于缺失突变质粒的拯救。研究结果为进一步探索PRRSV新型疫苗提供参考和奠定基础。