目的：　　 牙周病是人类最常见的慢性感染性疾病。近年来,许多国内外的专家研究证实牙周感染可能是引发全身系统疾病(心血管疾病、糖尿病、呼吸系统疾病、骨质疏松、低体重早产儿等)的独立或联合危险因素。　　 近年来,牙周病与呼吸道疾病,尤其是医院内获得性肺炎、慢性阻塞性肺疾病的关系越来越受到人们的重视。目前普遍认为牙菌斑以一种复杂的生物膜形式存在,是住院病人感染,尤其是呼吸道感染致病菌的储存库。绿脓假单胞菌(Pseudomon asaeruginosa,P.aeruginosa)是一种很重要的条件性细菌病原体,可以通过粘附和侵入宿主上皮细胞,导致呼吸道和其他全身系统的感染。研究发现口腔细菌,尤其是牙周可疑致病菌,如牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)等可显著增加P.aeruginosa侵入肺上皮细胞的数量,增强细胞因子白细胞介素-6(intedeukin-6,IL-6)和白细胞介素-8(intedeukin-8,IL-8)的释放,调控细胞凋亡,进而引发或加重呼吸道感染。　　 调控细胞凋亡的信号传导通路复杂多样,早期的研究报道表明P.gingivalis至少可以通过JAK/Stat3和PI3K/Akt两条信号传导通路调控宿主细胞的凋亡。其中JAK/Stat3信号传导通路代表的是一条极其快速的从细胞外到细胞核的信号传导通路。许多细胞因子(如IL-6等)可活化Star3,通过调节目的基因转录,进而影响细胞的增殖、凋亡、分化与转化。Survivin作为细胞凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,LAPs)中最小的成员,是Star3信号传导通路下游重要的靶基因,可通过直接或间接抑制凋亡蛋白酶caspase-3活性而阻断细胞凋亡。MaoS等研究证实P.gingivalis可通过JAK/Stat3信号传导通路,上调survivin的表达,抑制牙龈上皮细胞的凋亡。本课题组发现P.gingivalis的侵入可以抑制P.aeruginosa诱导的肺上皮细胞的凋亡,但其确切的机制仍然不明确。　　 本实验拟建P.aeruginosa和P.gingivalis单独和共同侵入肺上皮细胞的体外模型,通过RT-PCR、real-time RT-PCR和Western blot分别检测Stat3和Survivin mRNA及蛋白在P.aeruginosa和P.gingivalis侵入肺上皮细胞过程中不同时间点的表达,从转录和翻译两个层面探讨P.gingivalis是否通过Stat3/Survivin细胞内信号传导途径参与调控P.aeruginosa诱导的肺上皮细胞凋亡过程。　　 方法：　　 一、研究对象　　 呼吸道致病菌:绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa,ATCC BAA-47 PAO1模式株)　　 口腔细菌:牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis,FDC 381模式株)　　 呼吸道上皮细胞:A549细胞株(人肺腺癌细胞株,ATCC CCL-185)　　 二、研究方法　　 1、选择P.aeruginosaPAO1模式株、P.gingivalis381模式株和A549细胞株,建立P.aeruginosa和P.gingivalis单独和共同侵入肺上皮细胞(MOI=100:1)2、4、8、12小时的体外模型。　　 2、利用RT-PCR和real-time RT-PCR方法分别检测P.aeruginosa和P.Gingivalis单独或共同侵入A549细胞2、4、8、12小时后stat3和survivin mRNA的表达。　　 3、利用Western blot方法分别检测P.aeruginosa和P.gingivalis单独或共同侵入A549细胞2、4、8、12小时后Stat3和Survivin蛋白的表达。　　 三、统计学处理　　 结果以均数±标准差(mean+SD)表示。实验重复三次,采用SPSS13.0统计软件进行分析,各组间均数的比较采用方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果：　　 一、P.aeruginosa和P.gingivalis侵入对A549细胞star3mRNA表达的影响　　 P.aeruginosa单独侵入A549细胞2小时即可诱导stat3mRNA,其表达量为空白对照组的1.2倍,并持续表达至4小时,而后随着细菌侵入时间的延长,其表达水平逐渐降低;P.gingivalis单独侵入A549细胞8小时内,stat3 mRNA在基线水平上下波动;P.aeruginosa和P.gingivalis共同侵入A549细胞可辅助增强stat3 mRNA的表达(为空白对照组的1.66倍,P＜0.05),其表达水平亦随着细菌侵入时间的延长而下降。　　 二、P.aeruginosa和P.gingivalis侵入对A549细胞survivin mRNA表达的影响　　 2小时,P.aeruginosa和P.gingivalis单独或共同侵入A549细胞均诱导survivin mRNA的表达,其表达水平分别为空白对照组的1.18倍(PA01组)、1.21倍(Pg组)、1.45倍(PAO1+Pg组,P＜0.05),即P.aeruginosa和P.gingivalis共同侵入可显著增强这种诱导趋势,且差异有统计学意义。随着细菌侵入时间的延长,各处理组survivin mRNA的表达均逐渐下降。　　 三、P.aeruginosa和P.gingivalis侵入对A549细胞Stat3和Survivin蛋白表达的影响　　 相比较于P.aeruginosa和P.gingivalis单独侵入,P.aeruginosa和P.gingivalis共同侵入A549细胞2小时即可显著增强Star3和Survivin蛋白的表达,并分别持续高表达至4小时和8小时,而后随着细菌侵入时间的延长而二者的表达量均降低。　　 结论：　　 1、与P.aeruginosa单独侵入相比,P.aeruginosa和P.gingivalis共同侵入肺上皮细胞2小时即可显著增强Star3mRNA和蛋白的表达,随着细菌侵入时间的延长,其mRNA和蛋白表达量均下降,提示P.aeruginosa和P.gingivalis共同侵入肺上皮细胞可快速激活(2小时)Star3信号传导通路,随着细菌侵入时间的延长,该信号传导通路逐渐关闭。　　 2、与P.aeruginosa和P.gingivalis单独侵入相比,P.aeruginosa和P.gingivalis共同侵入肺上皮细胞2小时即可显著增强Survivin mRNA和蛋白的表达,促进肺上皮细胞的存活,而后随着细菌侵入时间的延长,Survivin mRNA和蛋白表达量均下降,其促细胞存活作用受到抑制。　　 3、P.aeruginosa和P.gingivalis共同作用于肺上皮细胞,可在一定时间内激活Stat3信号传导通路,而后通过调节Stat3下游的Survivin的表达,使肺上皮细胞在一定时间内处于抑制凋亡状态,以利于细菌在细胞内增殖。我们推测这可能是细菌侵入机体后,逃避宿主免疫防御的一种方式。