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第一部分尿毒症患者高级蛋白氧化产物与血管钙化的关系背景血管钙化是慢性肾脏病(CKD)患者心血管事件发生率和死亡率增加的重要危险因素。氧化应激在尿毒症患者中十分常见,能够预计总体和心血管的死亡率。高级蛋白氧化产物(AOPP)是近年来发现的氧化介导的蛋白质损伤的重要标志物。本研究探讨CKDⅤ期患者血中水平及其与动脉钙化的关系。方法入选50例CKDⅤ期患者,在行动静脉内瘘术中取部分桡动脉;同期10例年龄相匹配的胸外科胸腺瘤患者,在术中选取同级别的胸廓内动脉作对照。茜素红染色测定钙盐沉积。免疫组织化学方法测定骨特异性蛋白——骨桥蛋白(OPN)的表达。H.E.染色测定内膜中层厚度(IMT)、管壁/管腔比值。测定血清AOPP、钙、磷、iPTH水平。结果CKDⅤ期患者血清AOPP水平(90.22±55.88)umol/L明显高于健康对照者(35.79±4.31)umol/L(P<0.01)。50例桡动脉标本中发生血管钙化的有24例,发生率为48%,均发生在血管中膜,对照组均无钙化发生。50例桡动脉标本中44例中膜有OPN的阳性沉积(88%),其中24例钙化的桡动脉中膜均有OPN表达,26例无明显钙化的标本中也有20例(76.9%)中膜有OPN的表达。对照组无OPN阳性沉积。24例有动脉钙化者血清AOPP水平(122.52±66.9umol/L)明显高于26例无动脉钙化者(61.29±31.23umol/L)(P<0.01)。Pearson相关分析显示血清AOPP水平与血管钙化程度(r=0.791,P<0.001)、桡动脉IMT(r=0.691,P<0.001)及桡动脉管壁/管腔比值(r=0.354,,P<0.05)呈正相关。血管钙化程度与AOPP(r=0.791,P<0.001)、血清磷(r=0.602,P<0.01)、血iPTH水平(r=0.549,P<0.05)呈正相关。结论CKDⅤ期患者普遍存在高AOPP血症和血管钙化,血浆AOPP水平与血管钙化密切相关。第二部分AOPP促进人主动脉平滑肌细胞向成骨细胞转分化和钙化背景本文第一部分研究表明尿毒症患者血AOPP与动脉钙化密切相关。但血AOPP水平升高仅仅是氧化应激的伴随现象,还是参与了尿毒症状态下动脉钙化的发生发展呢?近年来已明确血管钙化是一种类似于骨和软骨形成的主动调节过程,伴随着血管平滑肌细胞(VSMCs)向成骨样细胞的转化,出现“骨样”蛋白,如骨桥蛋白、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等。有研究表明氧化应激(如MM-LDL、过氧化氢或黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶等)能够促进血管细胞向成骨细胞转分化。因此本试验是将AOPP直接作用于体外培养的人主动脉平滑肌细胞(HASMC),观察其是否有直接导致平滑肌细胞向成骨细胞转分化,进而促进血管钙化的作用。方法将人血清白蛋白(HSA)用浓次氯酸处理,制备AOPP-HSA,并测定其浓度。将AOPP-HSA作用于培养的人主动脉平滑肌细胞(HASMC),同时设立正常对照组和单纯HSA组(其蛋白浓度与AOPP-HSA中的蛋白浓度一致)。Real-time PCR测定干预各组72h后细胞的核结合因子α(cbfα)和骨桥蛋白(OPN)水平。Western blot方法测定各组干预14天后OPN和平滑肌细胞肌动蛋白α(SM-α-actin)的蛋白表达。各组干预14天后用浓盐酸脱钙,测定上清液的钙浓度,用细胞蛋白含量标化钙含量。结果干预72h后,Real-time PCR结果提示与对照组相比,AOPP能明显增加HASMC的cbf-α(16.03±0.45 vs.1.06±0.43,P<0.001=和OPN(4.62±0.34 vs.1.06±0.43,P<0.01=表达,而单纯HSA组cbfα-1(1.05±0.06 vs.1.06±0.43)和OPN(0.96±0.08 vs.1.06±0.43)的表达与对照组无明显差别。干预14天后,Western blot结果提示AOPP能明显诱导HASMC的OPN的表达,使SM-α-actin的表达明显减少,而单纯HSA无此作用。14天后AOPP-HSA组HSAMC的钙沉积明显高于对照组(42±2.65 vs.4.23±0.21,P<0.001),单纯HSA组与对照组相比其HASMC的钙沉积则无明显变化(4.3±0.35 vs.4.23±0.21,P>0.05)。结论AOPP直接作用能使HASMC明显降低了平滑肌细胞标志性蛋白SM-α-actin的表达,明显增加HASMC成骨细胞标志性蛋白OPN的表达,明显增加HASMC的cbfα的表达,使HASMC向成骨细胞分化,促进HASMC钙化。第三部分AOPP可能通过氧化应激和激活ERK通路促进平滑肌细胞向成骨细胞分化和促进钙化背景本部分进一步探讨AOPP介导平滑肌细胞向成骨细胞分化和促进钙化的可能机制。近来的研究提示AOPP不仅是氧化应激的产物,它本身也可能诱导或加重氧化应激。因此我们探讨AOPP是否通过氧化应激而促进HASMC的转分化。另外,分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的信号转导通路,特别是其中的ERK1,2途径,主要介导细胞增殖和分化的信号转导。且有研究表明MAPK的激活还能促进人间充质干细胞向成骨细胞转分化。本部分还研究AOPP是否通过激活MAPK通路促进平滑肌细胞向成骨细胞分化。方法AOPP-HSA分别干预HASMC 2h,4h,6h,8h,12h,16h,24h,48h,72h,以氧化敏感的荧光材料2’-7’-二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)染色,用流式细胞仪测定细胞内的氧化水平。HASMC用维生素E预孵育后再予AOPP作用6h,测定细胞内的氧化水平,AOPP干预14天后用Western blot测定骨桥蛋白(OPN)的表达,并测定细胞的钙含量。AOPP-HSA分别干预HASMC 10min,20min,30min,40min,50min,60min,Western blot方法测定p44/42 MAPK,phospho-p44/42MAPK,SAPK/JNK,phospho-SAPK/JNK,p38MAPK,phospho-p38MAPK的蛋白表达。HASMC用MEK1抑制剂PD98059预孵育后再予AOPP作用14d,Western blot测定骨桥蛋白(OPN)的表达,并测定细胞的钙含量。结果AOPP-HSA孵育HASMC2h后,细胞内平均荧光强度开始升高,约在6h达到高峰。单纯HSA、AOPP-HSA和维生素E预孵育+AOPP组分别干预HASMC6h后,HSA对细胞内氧化水平无明显影响,AOPP-HSA明显增加细胞内的氧化水平,维生素E预孵育后再予AOPP-HSA干预,细胞内氧化水平明显降低。维生素E预孵育能使AOPP-HSA诱导的HASMC表达OPN明显减少(P<0.01),钙沉积明显减少(20±1.00 vs.42±2.65 ug/mg蛋白,P<0.01)。AOPP能够明显的激活phospho-ERK。PD98059预孵育能使AOPP-HSA诱导的HASMC的OPN表达明显降低(P<0.01),使HASMC的钙沉积明显减少(17±1.00 vs.42±2.65ug/mg蛋白,P<0.01)。结论AOPP可能通过增加细胞内的氧化水平,和激活ERK通路促进平滑肌细胞向成骨细胞分化和促进钙化。