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成纤维细胞是创伤愈合过程中对组织再生、修复和重建功能至关重要的细胞,能够分泌胶原等细胞外基质成分和多种生长因子,促进伤口愈合。近年来,蚯蚓作为中国传统中药,普遍用于祛瘀和刺激伤口愈合等药理活性的研究,且有很多研究结果表明蚯蚓提取物能够促进创面愈合。然而,蚯蚓是如何作用于创面并促进组织存活的尚未知。本课题是以从鲜蚯蚓为原料,针对其促增殖作用进行工艺优化得到的蚯蚓活性蛋白(EAP),研究EAP对小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞的活性作用,并探讨EAP促进NIH3T3细胞增殖的信号通路。研究内容及结果如下1、蚯蚓蛋白提取工艺的优化及分离纯化。结合实验室前期研究,首先以MTT活性筛选方法,着重考察了盐析条件和脱盐条件对蚯蚓蛋白提取物活性的影响,并通过正交设计考察溶剂、温度、盐饱和度对蚯蚓粗蛋白活性的影响,确定了最优的提取工艺,即鲜蚯蚓加入两倍量的pH7.8的磷酸盐缓冲液冰浴匀浆,4℃静置4h,离心25min,取上清盐析至50%饱和度,4℃静置1h,离心25min,上清液用0.2μm的中空纤维膜组件超滤的方式除去大分子,然后用截留分子量为20k-50k中空纤维膜组件超滤的方式除盐。后面按照分离纯化流程,经过DEAE离子交换层析、S200凝胶柱层析和TSK高效凝胶层析得到EAP。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析得到的EAP为较单一的电泳纯蛋白,其分子量为58.84kDa,苯酚硫酸法测定糖含量为13.77%,双向电泳测定蛋白等电点为4左右,HPLC-ELSD分析含有11种已知氨基酸和多种未知成分。2、蚯蚓蛋白对NIH3T3细胞增值和迁移的作用通过MTT活性检测和Brdu掺入方法检测不同浓度EAP对NIH3T3细胞增殖的影响,结果说明EAP能够以剂量依赖的方式促进NIH3T3成纤维细胞DNA的复制,促进其增殖；流式细胞术检测细胞周期结果说明,EAP能够以剂量依赖的促进NIH3T3细胞从G1期向S期转变,显著提高S期细胞比例；WesternBlotting检测调控G1/S期检验点的CyclinDl蛋白表达,结果显示EAP作用后,CyclinD1表达水平有显著性提高。细胞划痕实验和Transwell小室的结果共同说明,EAP具有促进NIH3T3细胞迁移的活性,且其促细胞迁移作用具有剂量依赖性。3、EAP促进细胞增殖的具体信号通路及对细胞周期的影响首先选用不同的信号通路抑制剂,分别研究了EAP促进细胞增殖作用过程中不同信号通路的参与情况。MTT和Western blotting结果显示,MEK抑制剂PD98059和U0126预处理均可以显著抑制细胞增殖作用,并明显阻断EAP激活的ERK磷酸化。流式细胞术和Western blotting分别检测加入U0126后细胞周期和CyclinD1蛋白表达水平,结果表明U0126可显著阻断细胞周期进程和CyclinD1蛋白的表达水平然后采用MTT法检测B-Raf和Raf-1抑制剂预处理对细胞增殖无明显影响。接下来,MTT和Western blotting结果显示PI3K抑制剂LY294002(?)(?)处理可显著抑制EAP引起的细胞增殖,且抵制了Akt和ERK磷酸化水平升高,提示PI3K也参与了EAP促进NIH3T3细胞增殖的过程。综上,推断EAP促进NIH3T3(?)细胞增殖的作用机制为：EAP通过激活MEK/ERK信号通路,引起CyclinDl蛋白表达升高,促进细胞周期从G1期进入S期,最终引起细胞增殖,且Pi3K信号通路可能是ERK的上游,通过PI3K→Rac→PAK→MEK通路,影响ERK活化从而调控细胞增殖。上述结果为进一步了解EAP促进NIH3T3细胞增殖的潜在机制提供证据,能够促进烧烫伤药物的研发,为临床烧烫伤药物的作用机制提供参考,这对于以蚯蚓为原料的中药的合理应用意义重大。