木霉(Trichoderma spp.)是一类广泛分布于土壤、根围和叶际的腐生真菌,属于半知菌亚门,丛梗孢目,木霉属。人们很早以前就意识到木霉对多种植物病原菌具有良好的生物防治功能,是一种重要的生防因子。病毒病是一类重要的植物病害,能够严重影响农作物的产量和品质,给农业生产造成巨大损失。传统的化学防治方法极易使病毒产生抗药性,防治效果并不理想。微生物源抗植物病毒活性物质的发现,为解决这一问题提供了新的途径。研究表明,哈茨木霉和绿色木霉在黄瓜根部定植以后可以显著改善植株对黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染的抵抗能力。近几年,国内外对木霉生防作用和生防机制的研究主要集中在病原真菌和病原细菌上,有关木霉对植物病毒病的防治效果和相应生防机制的研究很少。Peptaibols是一类主要由木霉合成的特殊的抗菌肽,具有多种生物学活性,是重要的木霉次生代谢产物。本实验室从拟康氏木霉生防菌SMF2 (T. pseudokoningii SMF2)的固体培养物中分离提纯了一类peptaibols抗菌肽,命名为康宁霉素(trichokonins, TKs),前期研究工作表明TKs对植物病原真菌和病原细菌具有广谱的抗菌活性。例如,放线菌Apiocrea spp产生的两种peptaibols抗菌肽peptavirins A和peptavirins B对烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)有抑制作用。为了解产自拟康氏木霉的peptaibols抗菌肽——康宁霉素是否具有抗植物病毒活性,本论文以抗性烟草品种枯斑三生(Nicotiana tabacum L. cv. Samsun)为植物材料,通过体外钝化和诱导抗性两个方面研究了TKs对TMV的防治效果,并且进一步对TKs抗TMV的机制进行了探讨。除了生防作用之外,人们还发现许多木霉菌株同时具有促进植物生长的作用。到目前为止,已经有大量研究表明多种生防木霉可以直接促进农作物生长,提高农作物产量。但是关于木霉产peptaibols抗菌肽对植物生长发育的影响及其可能的作用机制却鲜有报道。本论文以TKs中主要的生物学活性成分康宁霉素VI (trichokonins VI, TK VI)为代表,研究了拟康氏木霉生防菌SMF2产的peptaibols抗菌肽对植物生长发育的影响,着重研究了TK VI对拟南芥根系形态建成的影响,并从激素生理调控机制的角度对其促生长机制进行了深入研究。本论文从生防和促生长两个角度对拟康氏木霉菌株SMF2产的peptaibols抗菌肽的生物学活性进行了研究,主要研究内容和结果如下：一、康宁霉素抗烟草花叶病毒活性及其作用机制研究1.康宁霉素对TMV的体外钝化作用将不同浓度TKs与TMV病毒精提液混合处理,用半叶法接种烟草叶片,培养6d后统计平均枯斑抑制率。结果显示,当处理浓度为20μM时,TKs可以对TMV产生明显的体外钝化作用,烟草的平均枯斑抑制率为58%。在100 nM的处理浓度下TKs对TMV虽然也表现出一定的钝化作用,可以导致电镜视野中部分TMV粒体形态的变化,但是这一浓度TKs处理后TMV对烟草的侵染力基本没有受到影响,烟草的平均枯斑抑制率仅为23%。因此我们推断TKs对TMV的体外钝化作用存在浓度依赖性,并且钝化并非TKs低浓度(100 nM)下抗TMV活性的主要作用机制。2.康宁霉素诱导烟草抗TMV活性及其作用机制研究用50 nM、100 nM和200 nM TKs喷施处理烟草幼苗下位叶片。诱导4d后在上位叶片接种TMV,统计烟草平均枯斑抑制率分别为15%、54%和35%。其中,TKs诱导浓度为100 nM时,对TMV具有最佳的诱导抗性作用。并且100 nMTKs诱导处理后接种TMV,烟草叶片平均枯斑直径和枯斑面积仅为对照组的57%和30%。以上实验结果显示TKs在低浓度(100 nM)下对烟草花叶病的防治机制主要为诱导植物抗性。进一步从生理和分子生物学的角度对TKs诱导植物抗性的机制进行了探讨。用100 nM TKs处理烟草可以诱导植物早期防御反应因子——活性氧和酚类物质的大量积累。同时,TKs处理还可以引起烟草防御酶系统中PAL、POD和PPO酶活性的增加。对部分抗病基因表达情况进行检测发现：植物体内活性氧清除系统中的关键酶基因以及与水杨酸、乙烯和茉莉酸信号转导途径相关的部分基因表达量均发生了不同幅度的上调。其中与水杨酸信号途径有关的酸性PR蛋白基因NtPR1a在喷施TKs后1 h内表达量提升了4.5倍。以上结果说明,TKs对植物的诱导抗性可以通过激活植物体内以水杨酸信号转导途径为主的复杂的防御反应机制来实现。二、康宁霉素Ⅵ对植物生长发育的影响及其机制研究1.康宁霉素Ⅵ对植物生长发育的影响选择双子叶植物拟南芥、烟草和苜蓿以及单子叶植物玉米、水稻和小麦为代表,初步研究了不同浓度TKⅥ对植物生长发育的影响。将不同浓度的TKⅥ添加到基本培养基(1/2 MS培养基)中。将拟南芥种子春化处理后进行竖直培养,在培养过程中观察记录幼苗的生长状况。结果表明,虽然拟南芥不同生态型(Col、Ws和Ler)对TKⅥ的敏感程度存在较大差异,但总体来看,在低浓度TKⅥ(5-500 nM)处理时都可以观察到不同程度的促生长现象。低浓度TKⅥ(5-50 nM)对烟草和苜蓿幼苗的生长同样存在不同程度的促进作用,高浓度(5μM)下表现为显著的生长抑制作用。与以上结果不同的是,TKⅥ处理浓度在5nM以上时对单子叶植物玉米、水稻和小麦幼苗的生长存在普遍的抑制作用。因此推断TK VI在低浓度(5-50 nM)下对双子叶植物存在明显的促生长作用,高浓度(5μM)下则严重抑制生长。但是与双子叶植物相比较,相同的处理浓度下TKⅥ对单子叶植物则具有更高的植物毒性。选择对TKⅥ敏感的拟南芥Col生态型进一步统计了TKⅥ对幼苗根系生长的影响。结果显示,50 nM TKⅥ对幼苗根系的生长促进作用最明显,TKⅥ处理后幼苗地上部分和地下部分的生物量分别为对照的1.7倍和2.3倍；而在5μM浓度下TKⅥ则表现出对幼苗生长的抑制作用,在这一处理浓度下幼苗的生长几乎停滞,生物量仅为对照的50%左右。对主根长度的统计表明：对于不同生长阶段的幼苗,TKⅥ对主根的促生长速率是一致的。对侧根的数目、侧根密度和不同侧根发育阶段所包含的侧根原基数量的统计显示：虽然50 nM TKⅥ处理可以使可见侧根数量明显增加,但是对侧根密度和侧根原基总数并没产生显著的影响。这一结果表明TKⅥ的促生长作用可能和诱导植物内源生长素合成无关。2.康宁霉素Ⅵ促进拟南芥根系生长的机制研究植物根系的生长包括顶端分生组织细胞的不断分裂和伸长区细胞的同步伸长两个部分。用体式镜和微分干涉显微镜观察,并用CycB1::GUS标记基因标记主根处在分裂期的细胞区域。结果表明,50 nM的TK VI处理可以使幼苗根尖分生区范围扩大,分裂活动旺盛,细胞数目增多。利用组织透明的方法处理根尖,观察并统计拟南芥根尖同一位置成熟区细胞长度。结果显示,与对照相比50 nM的TK VI处理后细胞长度增加了2倍。利用生长素响应的DR5::GFP转基因株系和生长素极性运输抑制剂NPA,进一步研究了不同浓度的TK VI对主根根尖中生长素分布情况的影响。结果证实,TK VI处理的确影响了根尖处生长素的分布。利用生长素输入载体AUX1和生长素输出载体PIN2的功能缺失突变体aux1-7和eir1-1研究了TK VI调控的生长素极性运输的分子机制。通过对主根长度和可见侧根数目的统计,发现TK VI引起的促生长作用主要与生长素输出载体的功能有关,而与生长素输入载体无关。进一步利用PINs::GFP转基因株系研究了TK VI对生长素输出载体分布和表达情况的影响。结果表明TK VI可以通过调控根部生长素输出载体PINs家族蛋白的活性,促进根部生长素的向顶运输,抑制生长素的向基运输。我们的研究结果显示,50 nMTKVI对拟南芥的生长具有明显的促进作用,这一促生长作用主要是通过改变生长素输出载体的表达和分布进而加强生长素在根部的向顶运输,抑制生长素的向基运输,并且最终导致内源生长素在根部的异常分布来实现的。