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前言 冠心病是严重威胁人类生命健康及生存质量的疾病，为中老年人三大主要死因之一。冠状动脉血运中断后，该血管支配区（危险区）内的心肌细胞缺血、缺氧，并逐渐发生细胞坏死。近年来，就如何最大限度地发挥与利用机体自身的抗损伤机制，各国学者进行了大量而深入的研究，心肌缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）就是最受瞩目的热点。 IPC定义为：反复短暂的冠脉缺血可以对抗随后长时间的冠脉缺血，产生减少梗塞面积的心脏保护作用。预适应保护存在两个时间段，第一个是在预刺激后即刻产生，并持续1～3小时的早期预适应，也被称为经典预适应，也是本研究所涉及的时程。另外一个阶段是延迟期预适应，它是在最初预刺激损伤出现后的12～72小时内发生的心肌保护现象，被命名为第二窗保护（SWOP）。 心肌缺血预适应对心肌的保护是迄今为止发现的最为强大的内源性保护，因此探讨IPC的特点及机制并服务于临床是目前各国学者研究的热点。然而IPC激发心肌抗缺血保护的确切机制至今未明。本课题以深入研究心肌缺血预适应的机制为目的，以目前国内外研究较少的β-肾上腺素受体信号转导通路、一氧化氮—环磷酸鸟苷信号通路及蛋白酪氨酸激酶活性变化为主线，旨在深入研究几条不同的信号转导通路在早期心肌缺血预适应中的作用机制及意义，以更好地为临床服务。 实验材料 一．实验动物 健康SD大鼠，体重270～320g，由中国医科大学实验动物部提供。 二．实验试剂 TTC，Evan’s Blue，心肌酶谱试剂盒，3H—双氢心得舒，cAMP放免分析试剂盒，[γ-32P]ATP，蛋白激酶A（PKA）单克隆抗体（第一部分）；一氧化氮试剂盒，一氧化氮合酶（NOS）活性测定试剂盒，cGMP放免测定试剂盒，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗体，免疫组织化学试剂盒（第二部分）；[γ／中二ATP，谷蛋白一酪蛋白聚合物，Whatman PSI离子交换滤纸（第三部分）。 三．实验仪器 动物人工呼吸机，心电图机，低温高速离心机，显微图像分析系统，液问计数仪，电泳槽，72分光光度计，石蜡包埋全自动处理仪，恒冷箱冰冻切片机。 实验方法 各部分首先应用套管法制作在体大鼠心肌缺血／再灌注损伤模型：大鼠经3％异戊巴比妥钠N0mg／Kg)腹腔注射麻醉后，气管插管，呼吸机辅助呼吸，接心电图肢体导联。沿胸骨左缘 0．5 cm剪断第 23上肋骨，以手术线牵拉两侧肋骨暴露胸腔。破心包，以肺动脉圆锥与左心耳之间的左冠状静脉为标志，在左冠状静脉下缝线，线两端共穿过一根聚乙烯小管以形成闭环。拉紧闭环并用止血钳固定即产生缺血，放松闭环即发生再灌注。实验中以左室前壁紫组及同步心电图标11导联S－T段抬高为结扎成功标志，对变化不明显者、穿线中大量出血者剔除实验。 第一部分 制作大鼠在体心肌缺血／再灌注损伤模型，将动物分为预适应组一P组，n＝12人手术穿线后平衡 sndn后结扎 smin，放松 smin，反复 3次后，持续结扎30min，再灌注 90min，结束实验。缺血／再灌注组 VR组，n二 12人手术穿线平衡35ndn后，持续结扎30ndn，再灌注90min，结束实验。假手术组＊ON组，n＝6入手术穿线后，不予处置，155ndn后结束实验。预适应程序组＊C组，n＝36)，在 PC组中进一步分为N－，2－，3－，和 PCI＋，2＋，3十组，每组n＝6。其中3周期sndn 缺血示为PCI－，2－，3－；间隔的smin再灌注示为 PCI＼2＼3＋。实验程序结束后，取血测量心肌酶谱＊P组与 I／R组各取6只行EvanA Blue及TI’C染色后，用计算机图像分析系统比较危险区＼梗死区面积及与左室总截面积的百分比关系。其余心脏匀浆后应用差异离心法分离胞浆与胞膜，o仰O法测定蛋白含量。胞膜应用放射受体分析法，Scatchnd作图测量p一肾上腺素受体（p－AR）最大结合力问max)及密度（KD人胞浆应用放射免疫法测量cAMP含量，生化法测量PKA／C活性，免疫引迹分析测量PKA含量。 ·2· 第二部分 模型制作及分组同第一部分。IP组及I／R组各取6只大鼠于实验程序结束后，取心脏平行房室沟将左室切成＊5－Zrnm薄片共5片，然后进行石蜡包埋，以SABC法进行内皮型一氧化氮合酶＊NOS）免疫组织化学研究。其余大鼠于实验程序结束后，取心匀浆后离心制备胞浆，o W’一法测定蛋白含量。放射免疫分析法测定。GMP含量，生化法应用药盒测定NO含量、NOS活性变化。 第三部分 模型制作及分组同第一部分。于实验程序结束取心匀浆后，离心制备胞浆，o Wr法测定蛋白含量，生化法测定o？：K活性。 实验结果 第一部分 门X心肌酶谱检测CK人K——MB及LDH，三种酶在IP组较I／R组有显著降低，P＜o．01。IP组与＊ON组之间，＊K人K＊B有显著差异人＊H未见明显差异。 p)IP组与I／R组比较左室总截面积，危险区面积，危险区／左室总截面积，差别不显著。但I／R组梗死区总面积经图像分析软件分析定量为7037 223437?