论文部分内容阅读
目的:食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Cancer，ESCC）一直是最常见的消化道恶性肿瘤之一，也居我国发病率之首。目前流行病学研究表明，在食管鳞状细胞癌的高发区如河北、河南等地的发病率和死亡率有逐年上升的趋势。食管癌的早期临床表现不明显，不易被发现，临床就诊患者多为中晚期；且对肿瘤患者治疗过程中的疗效缺乏及时的评估手段，所以我们希望找到一种对食管癌早期诊断和预后可以及时作出评估的分子标志物。近年来，表观遗传学在肿瘤形成过程中的作用已成为目前研究的热点之一，已证实基因启动子区甲基化在多种肿瘤的癌前病变中出现，已经证实基因启动子区甲基化是肿瘤发生的早期事件。因此，基因甲基化检测有希望成为肿瘤早期诊断的分子生物学方法。SPG20基因（痉挛性截瘫-20），位于13q13.3染色体上，其编码Spartin蛋白。SPG20基因启动子区甲基化存在于结、直肠腺癌患者的癌细胞中。但是，食管鳞癌中SPG20基因启动子区甲基化异常表达的研究在国内外尚未见报道。因此通过研究SPG20基因启动子区异常甲基化与食管鳞癌发生、发展之间的关系，有可能为食管鳞癌的发病机制提供强有力的分子生物学依据。本研究以河北医科大学第四医院胸外科2012年10月-2013年10月收治的食管鳞癌患者为研究对象，应用焦磷酸测序法定量检测SPG20基因甲基化状态与食管鳞癌发生，发展，浸润和转移的关系，进一步阐明SPG20基因甲基化状态在食管鳞癌发生、发展、浸润、转移中的作用。并通过对同一食管鳞癌患者鳞癌组织和外周血中SPG20基因甲基化的对比分析,阐明食管鳞癌患者外周血甲基化检测能否反映食管鳞癌组织甲基化状态；也可利用对外周血分子指标进行甲基化检测，作为高危人群预警、早期诊断和临床预后的分子标志和方法提供重要理论依据。同时也为揭示食管鳞癌发病的分子水平机制，基因治疗和临床预后等方面提供新的理论和试验依据。方法:1、收集河北医科大学第四医院2012年10月-2013年10月期间行手术治疗的原发性食管鳞癌患者的新鲜癌组织、正常食管粘膜组织(距肿瘤边缘5cm以上的正常食管粘膜)、术前外周血样本和健康志愿者外周血样本。2、焦磷酸测序法检测60例食管鳞癌癌组织、60例正常粘膜组织、食管鳞癌患者60例外周血及健康志愿者外周血30例中SPG20基因启动子区甲基化水平。3、应用免疫组织化学SP法分别检测60例食管鳞癌组织及正常粘膜组织中Spartin蛋白的表达情况。4、研究数据通过SPSS l3.0统计软件进行处理，应用x2检验、配对x2检验及Fisher’S确切概率法比较各指标的相互关系，检验结果以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、食管鳞癌患者癌组织、正常食管粘膜组织及其外周血标本各60例，健康志愿者外周血标本30例均成功进行了焦磷酸测序定量检测。以SPG20基因4个CpG位点甲基化平均值作为标本的甲基化水平，焦磷酸测序检测结果见图（Fig.1-Fig.4）。根据阈值（18.1%），食管鳞癌组SPG20甲基化平均水平明显高于正常粘膜对照组（P<0.01）；食管鳞癌患者外周血样本中SPG20甲基化平均水平明显高于健康人外周血样本（P<0.01）（Table1-2）。2、60例鳞癌组织SPG20基因启动子区高甲基化率为65%（39/60）。而60例正常粘膜组织SPG20基因启动子区高甲基化率为25%（15/60），SPG20基因在食管鳞癌患者中高甲基化率显著高于对照组（P＜0.01）（Table3）。3、食管鳞癌癌组织中SPG20高甲基化与其临床病理特征关系：TNM分期：Ⅰ期40.0%（2/5）、Ⅱ期40.0%（8/20）、Ⅲ期83%（29/35），其中Ⅰ期和Ⅱ期，两者差异无统计学意义（P>0.05）；Ⅰ期和Ⅲ期，两者差异有统计学意义（P<0.05）；Ⅱ期和Ⅲ期，两者差异有统计学意义（P<0.05）。有淋巴结转移组SPG20基因启动子区高甲基化率80%（29/36）显著高于无淋巴结转移组高甲基化发生率41%（10/24）（P<0.05）。SPG20基因高甲基化水平与食管鳞癌患者的性别、年龄、吸烟情况及肿瘤分化程度无关（P>0.05）（Table4）。4、60例食管鳞癌组织中，其中25例Spartin蛋白表达呈阳性，阳性表达率为41.7%；正常粘膜组织60例，其中49例Spartin基因蛋白表达呈阳性，阳性表达率为81.7%，正常粘膜组织Spartin蛋白阳性表达率显著高于食管鳞癌组织（P<0.05）。食管鳞癌组织中的Spartin蛋白，有淋巴结转移组阳性表达率为53%（19/36），无淋巴结转移组阳性表达率为25%（6/24），差异有统计学意义（P<0.05），但与患者的性别、吸烟情况、肿瘤组织的分化程度及TNM分期无无关（P>0.05）（Table5-6）。5、60例食管鳞癌患者外周血SPG20基因启动子区高甲基化率为51.7%（31/60），而30例对照组SPG20基因启动子区高甲基化率为16.7%（5/30）；食管鳞癌患者外周血高甲基化率显著高于对照组（P＜0.01）（Table7）。6、食管鳞癌的外周血中SPG20基因高甲基化与其临床病理特征关系：在食管鳞癌患者外周血中，SPG20基因启动子区在淋巴结转移阳性组的高甲基化发生率67%（24/36）显著高于淋巴结转移阴性组的高甲基化发生率29%（7/24）（P<0.05）。外周血中SPG20基因甲基化水平与食管鳞癌患者的性别、吸烟情况、肿瘤分化程度及分期等无关（P>0.05）（Table8）。7、60例食管鳞癌组织SPG20基因启动子区高甲基化率为65%（39/60），外周血中高甲基化率为51.7%（31/60）；39例鳞癌组织高甲基化的患者中有27例外周血高甲基化69.2%（27/39），21例鳞癌组织高甲基化阴性的患者中有18例外周血高甲基化阴性85.7%（18/21）。8、Spartin蛋白表达与其甲基化水平的关系：食管鳞癌组织中SPG20基因启动子区发生高甲基化的组织中Spartin蛋白表达阳性率为25.6%（10/39），而SPG20基因启动子区未发生高甲基化的食管鳞癌组织中Spartin蛋白表达阳性率为71.4%（15/21），两者差异有统计学意义（P<0.05）（Table9）。结论：1、SPG20在食管鳞癌组织中的高甲基化发生率显著高于正常粘膜组织，SPG20基因在食管鳞癌患者外周血中的高甲基化率显著高于正常对照组。提示SPG20基因启动子区高甲基化可能与食管鳞癌的发生有关。2、外周血中SPG20基因启动子区甲基化水平可以反映食管鳞癌组织中SPG20基因启动子区甲基化的状态,可为食管鳞癌的筛选及疗效检测提供了一个潜在的生物学指标。3、食管鳞癌患者组织中SPG20基因启动子区高甲基化水平与其TNM分期及淋巴结转移有关,同时外周血中SPG20基因启动子区高甲基化水平与淋巴结转移有关，提示SPG20基因可能与食管鳞癌的发生发展及预后相关。4、食管鳞癌组织Spartin蛋白低表达可能与食管鳞癌发生发展有关。