棉花黄萎病菌落叶型菌系在山东的分布、毒素测定及生防细菌筛选

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棉花黄萎病是山东棉花生产中最严重的病害,年发生面积700多万亩,常造成巨大的经济损失,直接影响我省的棉花生产。近年来,棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae.Kleb)的致病力发生了明显变化,特别是落叶型菌系在田间的广泛出现,对我省的棉花生产造成越来越严重的影响。因此,了解落叶型菌系的特点及其在山东的分布,对有效控制棉花黄萎病的发生及传播,具有十分重要的意义。本研究从山东德州、东营和泰安等地棉花黄萎病发生田采集病株样品,经分离纯化,获得202株分离物,经培养性状观察、特异性引物扩增及致病力分析,发现落叶型菌系在我省分布十分广泛。对部分菌株的产毒能力及致病力进行了分析,发现各菌株产毒能力有较大差异。从不同地区采集土壤样本,筛选、鉴定出对黄萎病菌有明显拮抗作用的细菌菌株8株,为进一步对棉花黄萎病的生物防治提供了菌株材料。具体研究结果如下:  ⑴于棉花黄萎病盛发期,从山东德州、东营、泰安等地采集棉花黄萎病标本,采用组织分离法,获得202株分离物。  ⑵对各菌株的培养特征观察表明,202株分离物中,201株为菌核型,菌落黑色、白色气生菌丝稀薄或浓密,产生大量微菌核;1株为菌丝型,菌落白色、菌丝棉絮状、无微菌核和黑色素产生。  ⑶用大丽花轮枝菌(Verticillium dahliae)特异性引物DB19/DB22对202株分离物进行PCR扩增,发现所有分离物均可扩增出一条530bp左右的特异性条带,表明202株分离物均为V.dahliae。  ⑷为分析落叶型菌系在山东的分布,分别用2对特异性引物(INTD2f/INTD2r和INTND2f/INTND2r)对202株分离物进行PCR扩增,结果发现,其中201个分离物都在INTD2f/INTD2r作用下扩增出一条460bp左右的特异性条带,表明这些菌株为落叶型菌系,占所有分离物的99.5%;仅有1株分离物(HLX5-1-1)在非落叶型引物INTND2f/INTND2r作用下扩增出一条800bp左右的条带,占所有分离物的0.5%。表明落叶型菌系在山东各棉区分布广泛。  ⑸随机选取8株分离物对其产毒能力、毒素对棉花种子萌发和棉苗的致萎作用进行分析,结果发现菌株HDF4-3-1产毒能力最强,菌株3-5毒素产生量最小,表明不同菌株的产毒能力具有差异。用毒素处理棉花种子和幼苗,发现菌株HDF5-3-1的抑制率和致萎指数最高,非落叶型菌系HLX5-1-1最低,表明不同菌株的致病力存在差异。  ⑹测定了8株生防细菌的拮抗效果,结果发现:菌株JK-14对黄萎病菌的抑菌半径最大,为24.0 mm,菌株A12抑菌半径最小,为11.0 mm。表明菌株之间的拮抗性存在差异。经16S rDNA鉴定,A12为吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia),将菌株X-11、JK-14、SF-19、SF-23初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus spp),菌株JK-19、JK-28、JK-25初步鉴定为类芽孢杆菌属(Peanibacillus spp)。
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