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[目的]
肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是由激活的巨噬细胞产生的一种多功能细胞因子,其最显著的特征是在体内外能直接杀伤肿瘤细胞,是一种具有潜在应用价值的抗肿瘤生物制剂。使用染色体组TNF-α全长基因(含三个内含子)和cDNA基因构建真核表达载体,并转染真核细胞,观察外源TNF-α表达对细胞内自身TNF-α基因表达的影响;初步探讨TNF-α内含子对染色体组TNF-α基因表达的影响。
[方法]
从人Hella细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增出TNF-α的cDNA基因序列并构建至真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒中,重组载体命名为TF。从人Hella细胞中提取染色体组总DNA,用PCR方法扩增出全长TNF-α基因序列并构建至真核表达载pcDNA3.1(+)质粒中,挑取正向、反向质粒各一个(把neo基因与TNF-α cDNA的转录方向一致时的质粒,称为正向质粒;方向相反,则称为反向质粒),测序证实后,重组正向质粒载体命名TIA,重组反向质粒载体命名为TIB。TF、TIA、TIB经脂质体瞬时转染CNE-2Z细胞、A549细胞、Hella细胞和K562细胞,转染48h后提取细胞总RNA分别进行RT-PCR分析检测内源性和外源性基因的表达情况。用体外诊断试剂盒检测肿瘤坏死因子的蛋白表达量。
[结果]
TF和TIA质粒经脂质体瞬时转染在CNE-2Z细胞,A549细胞,Hella细胞和K562细胞中成功;TF和TIA质粒在细胞内表达,TIB质粒在细胞内不表达;TIA质粒在转染CNE-2Z细胞、A549细胞、Hella细胞和K562细胞中产生的TNF-α的表达量比TF质粒转染细胞产生的表达量低。
[结论]
导入外源TNF-α全长基因序列和TNF-αcDNA序列均能使细胞内TNF-αmRNA表达的量和肿瘤坏死因子蛋白的表达量增加;而导入外源TNF-α全长基因序列比导入TNF-α cDNA序列使细胞内TNF-αmRNA和蛋白表达的量低。