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腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease,CMT）又称为遗传性运动感觉性神经病（Hereditary Motor and Sensory Neuropathy,HMSN）,是最常见的遗传性周围神经病,具有高度的临床和遗传异质性,临床上以肢体远端肌肉进行性对称性的萎缩、无力、腱反射减弱和感觉减退等为主要特征,发病率约为1/2500。根据电生理和病理学特点,CMT可分为脱髓鞘型（CMT1）和轴索型（CMT2）,根据遗传方式的不同,CMT可呈常染色体显性遗传（AD）、常染色体隐性遗传（AR）和X连锁遗传（XD/XR）。随着分子遗传学的发展,迄今为止,腓骨肌萎缩症的基因型己达32型,其中22型已克隆。2004年,我们将一个来自中国湖南和湖北的常染色体显性遗传的CMT2型大家系定位在12q24.2-12q24.3之间的6.8cM区域,命名为CMT2L型（OMIM号608673）,随后通过候选基因克隆策略,在该定位区间发现了小分子热休克蛋白22基因（Small heat shock protein 22,HSP22）的423G→T错义突变,导致氨基酸K141N的替换,与该CMT2L型家系的疾病表型共分离,从而证实HSP22为CMT2L型的致病基因。研究表明,CMT各亚型致病基因的分子发病机制并不完全一样,可能通过致病基因的剂量效应、功能丧失、功能获得或显性-负性作用而致病。国外研究表明,HSP22与HSP27存在蛋白-蛋白相互作用,而且还发现,HSP22可能与调节HSP27的活性有关,HSP22基因的K141N突变后并没有破坏其编码蛋白与HSP27的相互作用,相反,这种相互作用还增强了并且导致蛋白聚集物的形成,表明K141N突变可能是通过功能获得作用而致病。为了证实上述推测,我们拟应用微纤维注射技术构建HSP22基因K141N的转基因小鼠模型,使小鼠携带人类突变的HSP22蛋白,验证该突变的功能获得作用。最近的研究发现,HSP27突变后也可引起CMT,HSP22和HSP27基因突变可以引起同样的疾病表型,这无疑为CMT发病机制的相关性研究提供了一个很好的线索和思路。通过对HSP27过表达转基因小鼠模型进行研究,发现HSP27不仅对癫痫后的病理改变、心肌缺血和脑缺血之后的再灌注损伤都有保护作用,而且对神经损伤修复、肌肉功能的维持也有重要作用。HSP22是否具有同样的功能,目前国内外尚无系列的研究报道,也无关于HSP22的过表达转基因小鼠构建的报道。因此,为了更好的研究HSP22基因的功能及该基因突变后的分子致病机制,构建HSP22的过表达转基因小鼠模型是非常必要的。为了构建携带人类HSP22基因K141N突变和野生型HSP22基因的转基因小鼠模型,我们成功构建了pCAGGS-HA-K141NHSP22和pCAGGS-HA-wtHSP22两个转基因表达载体。通过激光共聚焦显微镜和Western Blot分析,证实了pCAGGS-HA-K141NHSP22和pCAGGS-HA-wtHSP22可在真核细胞有效表达,并验证了K141N突变型HSP22在活体外细胞系中形成以核周分布为主的聚合物,野生型HSP22在活体外细胞系中弥散分布于胞浆和胞核内。应用HA单克隆抗体,可以特异性检测出约25.5kDa大小的带HA-tag的HSP22蛋白。体外实验证实pCAGGS-HA-K141NHSP22和pCAGGS-HA-wtHSP22能用于转基因小鼠的构建后,我们用SalⅠ、HindⅢ和BsaⅪ三个核酸内切酶对pCAGGS-HA-K141NHSP22和pCAGGS-HA-wtHSP22进行酶切得到线性化目的片段,然后进行微纤维注射。pCAGGS-HA-K141NHSP22线性化片段进行三次微纤维注射,共注射640枚受精卵,生下24只仔鼠,经PCR和测序分析,获得4只携带人类HSP22基因K141N突变的转基因首建鼠,编号为Tg642、Tg677、Tg679和Tg681。首建鼠Tg642已到交配年龄,使其与正常小鼠进行交配,已生下3批共23只F1代小鼠,经PCR鉴定,获得4只携带人类HSP22基因K141N突变的F1代转基因小鼠,编号为Be423、Be435、Bf84和Bf86,经Western Blot分析,该Tg642系小鼠并不表达目的蛋白,其他三个品系小鼠有待进一步鉴定。pCAGGS-HA-wtHSP22线性化片段进行一次微纤维注射,共注射210枚受精卵,生下19只仔鼠,经PCR和测序分析,获得4只携带人类HSP22基因的转基因首建鼠,编号为Tg646、Tg648、Tg649和Tg661。在获得更多pCAGGS-HA-K141NHSP22子代转基因阳性小鼠的基础上,我们将继续进行外源性突变HSP22蛋白的表达分析,如成功表达,再进行下一步的行为学、电生理学和病理学等方面的分析,以期获得CMT2L的转基因小鼠模型,为CMT的分子发病机制和治疗研究奠定基础。在获得pCAGGS-HA-wtHSP22子代转基因阳性小鼠的基础上,分析外源性HSP22蛋白的过表达情况,如能得到过表达HSP22蛋白的转基因阳性小鼠,后续的工作可围绕HSP22的神经保护作用进行,例如用HSP22过表达的转基因阳性小鼠与阿尔茨海默病（Alzhermer’s Disease,AD）、帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）、肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic LateralSclerosis,ALS）等神经退行性疾病的小鼠模型进行交配,也使这些神经退行性疾病的小鼠模型过表达HSP22蛋白,观察HSP22对上述神经退行性疾病的病理改变是否有保护作用,从而为神经退行性疾病的治疗研究提供新的思路。