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目的1.建立血液、尿液及组织中氯氮平(Clozapine, CLP)及主要代谢物去甲氯氮平(demethylclozapine, DMCLP)、氯氮平氮氧化物(N-oxidation-clozapine, CLP-NO)的固相萃取/液相色谱-质谱(SPE-LC/MS)的检测方法。2.研究CLP及其代谢物死后分布及死后弥散规律,为氯氮平中毒死亡案件的法医学鉴定提供实验依据。方法1.氯氮平及其代谢物的SPE和LC/MS/MS分析:对检材预处理后,采用OASIS(?)HLB3cc(60mg)固相萃取小柱对检材进行提取净化,采用Agilent(?)XDB-C18液相柱(4.6mm×150mm×3.5um)作为液相色谱柱,进行LC/MS/MS检测。2.死后分布:新西兰大白兔6只,雄性,隔夜禁食,随机分成两组,用氯氮平分别以LDso剂量(270mg/kg)与4LDso剂量(1080mg/kg)给实验动物(新西兰大白兔)灌胃,待实验动物心跳呼吸等生命体征全部消失后,迅速解剖动物,提取心血、尿、脑、心、肝、脾、肺、’肾等检材,冷冻保存,经固相萃取后,LC/MS/MS定性定量检测其中CLP及其代谢物(DMCLP和CLP-NO)的含量,定性检测葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G)。3.死后弥散:新西兰大白兔33只,雄性,隔夜禁食,随机分为死后弥散组(15只),温度影响组(6只),剂量影响组(6只)和灌胃时间影响组(6只)。死后弥散组:将新西兰大白兔固定于兔台上,夹闭气管处死,死后1h以LD50(270mg/kg)剂量CLP给实验动物(新西兰大白兔)灌胃染毒,染毒后实验动物置于常温条件下,分别于0.5d,1d,2d,4d,6d各解剖3只实验动物,提取脑、心、肺、肝、肾、右下肢、玻璃体液、心血、尿、胆汁,-20℃保存,经固相萃取后,LC-MS/MS定性定量检测其中CLP及其代谢物(DMCLP和CLP-NO)含量,定性检测葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G)。温度影响组:将新西兰大白兔固定在兔台上,夹闭气管处死,死后1h以LD50(270mg/kg)剂量CLP给实验动物(新西兰大白兔)灌胃染毒,将染毒后实验动物各三只分别置于-20℃,4℃及常温条件下保存,4d后全部解剖,提取脑、心、肺、肝、肾、右下肢、玻璃体液、心血、尿、胆汁,检材于-20℃保存,经固相萃取后,LC-MS/MS定性定量检测其中CLP及其代谢物(DMCLP和CLP-NO)含量,定性检测葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G)。剂量影响组:将新西兰大白兔固定在兔台上,夹闭气管处死,死后1h分别以1/2LD50(135mg/kg)、LD50(270mg/kg)剂量CLP给实验动物(新西兰大白兔)灌胃染毒,将染毒后实验动物置于常温条件下,4d后解剖,提取脑、心、肺、肝、肾、右下肢、玻璃体液、心血、尿、胆汁,检材于-20℃保存,后经固相萃取,LC-MS/MS定性定量检测其中CLP及其代谢物(DMCLP和CLP-NO)含量,定性检测葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G)。灌胃时间影响组:将新西兰大白兔固定在兔台上,夹闭气管处死,于死后1h、3h、6h分别以LD50(270mg/kg)剂量CLP给实验动物(新西兰大白兔)灌胃染毒,将染毒后实验动物置于常温条件下,4d后解剖,提取脑、心、肺、肝、肾、右下肢、玻璃体液、心血、尿、胆汁,检材于-20℃保存,经固相萃取后,LC-MS/MS定性定量检测其中CLP及其代谢物(DMCLP和CLP-NO)含量,定性检测葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G)。4.采用SPSS11.5统计软件处理实验数据,结果以x±S表示。结果1.氯氮平及其代谢物SPE-LC/MS/MS分析①采用Agilent(?)DB-C18(4.6mm×150mm×3.5um)液相柱,前接phenomenex保护柱(DIKMA公司,美国)作为液相色谱柱,目标物出峰最宜;血、尿及组织样品中加入适量2.5moL/L碳酸钠调PH至11时目标物回收率最佳;采用OASIS(?)HLB3cc(60mg)柱固相萃取进行提取,较液液萃取(乙酸乙酯)提取回收率高。②液相色谱/质谱检验(LC/MS):使用电喷雾正离子源(+),采用多反应监测MRM扫描方式,MRM监测各组分离子对进行定性,氯氮平的定量离子对(327/192),去甲氯氮平(313/270.2),氯氮平-N-氧化物(343/243.1),葡萄糖醛酸氯氮平(503/327),安定(313/154.1),尿液中CLP、DCLP、CLP-NO的线性检测范围为5或10-1000ng/mL,最低检测浓度分别为5或10ng/mL;血液中CLP、DCLP、CLP-NO的线性检测范围为2或5-1000ng/mL,最低检测浓度为2或5ng/mL;肝中CLP、DCLP、CLP-NO的线性检测范围为50-1000ng/mL,最低检测浓度为50ng/mL。2.死后分布LD50组及4LD50组染毒致死家兔体液和组织中均检出CLP、DMCLP和CLP-NO,尿液中均检出CLP-G,其余组织和体液中未检出CLP-G。LD50灌胃组:CLP含量从高到低分别为:肺>肝、肾、脑、脾>胆汁、心肌、心血>尿、玻璃体液、下肢肌;DMCLP在各脏器的含量从高到低分别为肺、肝>肾、脑、脾>胆汁、心肌、心血、尿、玻璃体液>下肢肌;CLP-NO在各脏器的含量从高到低分别为肺、肝>肾、脑、脾>胆汁、心肌、>心血、尿、玻璃体液、下肢肌。4LD50灌胃组:CLP含量从高到低分别为:肺、肝>肾、脑、脾>胆汁、心肌>心血、尿、玻璃体液、下肢肌;DMCLP含量从高到低分别为肺、肝>肾、脑、脾>心肌、胆汁、心血、尿、玻璃体液>下肢肌;CLP-NO含量从高到低分别为肺、肝>肾、脑、心肌>脾、胆汁、心血、玻璃体液、尿>下肢肌。3.死后弥散死后弥散动物模型中,所有检材中均未检出氯氮平代谢物。死后弥散组:LD50染毒家兔死后常温保存时,0.5d后心肌、心血、肺、肝、肾均检CLP,1d后脑、下肢肌中也检测出CLP,2d后胆汁也检出CLP,玻璃体及尿液一直未检出CLP。温度影响组:-20℃组肝、脾、肺中均检出CLP,其余均未检出CLP;4℃组心、肝、脾、肺、肾、脑均检出CLP;常温组除尿、玻璃体液未检出CLP外,其余均检出CLP。剂量影响组:1/2LD50、LD50、2LD50三种剂量下,尿、下肢肌均未检出CLP,心肌中CLP的浓度随着灌胃药物浓度的增大而增大。灌胃时间影响组:1h组尿、玻璃体液中未检出CLP;3h组尿、玻璃体液、下肢肌中未检出CLP;6h组尿、玻璃体液、下肢肌、心、肾中未检出CLP,各组其余组织和体液中均检出CLP。结论1.本文建立同时测定生物检材中CLP、CLP、DMCLP和CLP-NO定性、定量及CLP-G定性的SPE-LC/MS/MS检测法,回收率高,重现性好,特异性高,灵敏度高,适用于临床中毒的快速检验和法医中毒案件的检验。2.CLP及其代谢物在染毒致死家兔体内分布不均匀。LD50组及4LD50组染毒致死家兔体液和组织中均检出CLP、DMCLP和CLP-NO,尿液中均检出CLP-G,其余组织和体液中未检出CLP-G。3.本实验再次证明CLP在家兔体内可发生死后弥散,保存时间、保存温度和灌胃时间可影响其死后弥散,同时发现6d内所有死后染毒家兔体内均未检出CLP的代谢物DMCLPCLP-NO和CLP-G。4.比较CLP及其代谢物的死后分布和死后弥散结果提示, DMCLP、 CLP-NO、CLP-G可能成为CLP生前服药的标志物,尿中检出CLP-G可能成为CLP中毒(死)案件法医学鉴定中生前服毒和死后染毒鉴别的依据。