妊娠滋养细胞疾病包括完全、部分和侵袭性葡萄胎,胎盘滋养细胞肿瘤以及绒癌。因为人类滋养细胞是有异于体细胞的特殊细胞,具有独特的分化特点和生物学特性,与人类其他的肿瘤细胞相似。因此,研究妊娠滋养细胞疾病的发生、发展机制已成为当前妊娠滋养细胞疾病基础研究的一个重要领域。由于正常绒毛组织体外分离培养的限制,使得经典基因转染研究方法难以实施。所以,我们采用RNA干扰(RNAi)技术从反向遗传学的角度来阐明F10基因的功能。RNA干扰(RNAi,RNA interference)是一种首先在线虫中发现的转录后基因沉默现象(PTGS,post—transcriptional gene silencing),由双链RNA(dsRNA,double-strand RNA)启动,并导致具有同源序列mRNA的降解。2001年,Tuschl的实验室首先报道化学合成的21bp小干扰RNA(siRNA,smallinterfering RNA)在哺乳动物细胞能序列特异地抑制基因表达,又不至于激活宿主细胞的抗病毒反应,使得RNAi技术被证实为一项快速有效的、适宜高通量的基因功能分析技术。反向遗传学技术也因此成为目前研究基因功能的有效手段。在反向遗传学研究中,反义寡核苷酸和核酶技术曾被应用,但其应用程度和效果极低。目前,除同源重组介导的基因敲除(knock-out)外,还没有其他通用的反向遗传学技术。基因敲除技术由于操作费时、费用昂贵及成功率低大大地限制了其广泛应用,并且基因敲除不适于人类细胞。与传统的反义核酸技术相比,通过双链RNA起作用的RNAi具有如下优点:双链RNA比反义核酸更为稳定,不容易被降解;相同量的双链RNA抑制基因表达的效果至少比反义核酸显著;高特异性,靶基因mRNA一个碱基的变异即可使siRNA失去RNAi效果;绝大多数基因的表达都能被双链RNA介导的RNAi所抑制。所以,RNA干扰作为一种新的反向遗传学技术引起广泛关注,并在基因功能的研究中得以应用。肿瘤发生相关基因的异常表达是肿瘤发生的一个重要原因,因此抑制肿瘤相关基因表达的研究成为肿瘤发病机制中的重要方面。2005年,我们前期通过抑制性消减杂交技术,获得了正常早孕绒毛膜组织与葡萄胎组织之间的消减文库,并从中分离出一个在葡萄胎中高表达的新基因—F10;采用原位杂交方法检测12例葡萄胎,6例侵袭性葡萄胎,8例绒癌中F10基因表达情况。结果F10基因在全部葡萄胎、侵袭性葡萄胎、绒癌中均呈阳性表达;其在葡萄胎,侵袭性葡萄胎、绒癌中的表达强度递增。研究证明F10可能与滋养细胞肿瘤的发生及其侵袭行为相关,在侵袭或滋养细胞恶变中起一定作用。2006年,课题组采用原位杂交方法检测不同肿瘤组织和正常组织的F10基因mRNA表达。结果发现F10基因在卵巢腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等腺癌中阳性表达,不同腺癌之间阳性表达差异无显著性。子宫内膜、宫颈上皮等正常组织、肝癌癌旁组织中F10基因呈阴性表达。上述研究证实:葡萄胎差异表达新基因F10不仅与滋养细胞肿瘤密切相关,可能还在某些腺癌发生发展中起重要作用。葡萄胎差异表达新基因F10是本课题组前期研究中发现的新基因,本课题通过以RNA干扰(RNA interference RNAi)为基础的基因沉默技术对F10基因的功能及机理进行初步研究。第一部分瞬时转染dsRNA确定F10基因沉默对KLE细胞凋亡的影响一研究内容与方法探讨小分子双链RNA对KLE细胞中F10基因的沉默效应,并确定F10基因沉默对KLE细胞凋亡的影响。采用体外转录法制备针对F10基因的dsRNA;脂质体转染KLE细胞,Taqman探针法荧光定量PCR检测dsRNA转染KLE细胞不同时间后细胞中F10基因的表达水平;流式细胞术检测F10基因沉默后KLE细胞凋亡的改变。二结果1、体外转录法能制备足够的dsRNA,丙烯酰胺凝胶电泳见dsRNA分子量为21bp左右。经检测ds RNA浓度为740 ng/μl(52.85μmol/L)2、Taqman探针法荧光定量PCR检测显示:与对照组相比,10nM,20nM和50nM的dsRNA转染KLE细胞后24小时均出现F10基因拷贝数的下调,20nM和50nM的dsRNA转染可导致KLE细胞F10表达显著下调,并且基因下调一直维持到转染后72小时。其中20nM dsRNA转染48小时获得最大的F10基因沉默效应,F10基因表达下调达83%。3、流式细胞术对KLE细胞DNA含量的检测发现:20nM dsRNA转染48小时后,KLE细胞凋亡率升高到8.91%,对照组在转染48小时后细胞凋亡率为0.36%,实验组的凋亡率是对照组细胞的24.75倍。三小结1、通过体外转录法制备针对F10基因的dsRNA;脂质体转染KLE细胞,Taqman探针法荧光定量PCR检测dsRNA转染KLE细胞不同时间后细胞中F10基因的表达水平,提示:体外转录制备针对F10基因的dsRNA能特异有效沉默KLE细胞中的F10基因。2、流式细胞术对KLE细胞DNA含量的检测发现F10基因的表达下调可诱导KLE细胞的凋亡。第二部分沉默载体的构建和稳定克隆的建立一研究内容与方法针对F10基因设计能转录生成发卡样siRNA的寡核苷酸片段,构建出pRetroQ-i F10重组体并建立F10基因表达稳定下调的KLE细胞系。依据GenBank中F10基因(Genbank NO.gi:5641046)的序列,用设计分析软件进行筛选序列,确定能制备针对F10基因siRNA的寡核苷酸序列。合成单链寡核苷酸,片段退火成双链DNA,将两条合成的寡核苷酸退火后形成的双链DNA连接到逆转录病毒载体pRetroQ上构建重组质粒pRetroQ-i F10,脂质体转染KLE细胞,嘌呤霉素筛选,获得单细胞克隆.二结果1对构建的pRetroQ/i F10重组质粒测序结果证实shRNA表达模板成功克隆于pRetroQ载体上,插入序列完全正确无碱基突变和缺失。2对筛选获得的单细胞克隆进行F10基因的荧光定量RT-PCR检测发现:2个RetroQ/negative细胞克隆中F10表达水平没有明显差别;5个pRetroQ/RNAi细胞克隆出现不同程度的F10表达下调,其中2个克隆F10基因表达下调超过70%,其中一个克隆下调达到74%,确定为F10有效沉默的阳性克隆。三小结1、对F10基因设计能转录生成发卡样siRNA的寡核苷酸片段,构建出pRetroQ-iF10重组体。对构建的pRetroQ/i F10重组质粒测序结果证实shRNA表达模板成功克隆于pRetroQ载体上。2、用设计分析软件进行筛选序列,确定能制备针对F10基因siRNA的寡核苷酸序列。合成双链DNA,连接到逆转录病毒载体pRetroQ上构建重组质粒pRetroQ-iF10,脂质体转染KLE细胞,嘌呤霉素筛选,获得单细胞克隆。3、对筛选获得的单细胞克隆进行F10基因的荧光定量RT-PCR检测并确定了F10有效沉默的阳性克隆。第三部分F10基因沉默对KLE细胞凋亡的影响及机理一研究内容与方法以F10基因表达稳定下调的KLE细胞克隆为模型,深入探讨F10基因沉默对KLE细胞凋亡的影响及机制。Annexin-v检测KLE细胞凋亡,荧光定量RT-PCR和western blot检测细胞色素C和Bcl-2表达水平。二结果1、流式细胞术检测发现:阴性对照组细胞的凋亡率为1.8%,F10基因沉默的细胞克隆,其凋亡率增加至16.8%,凋亡水平显著高于对照组。2、荧光定量PCR检测显示,F10沉默的细胞克隆中细胞色素C mRNA表达升高达到85%,显著高于对照组(P＜0.05)KLE细胞与对照组细胞之间无显著差异。3、Western印迹检测结果显示:KLE细胞、阴性对照组细胞和F10沉默实验组细胞线粒体中细胞色素C蛋白的相对表达量分别为:0.46、0.38和0.13,F10沉默实验组呈现蛋白表达降低。而胞浆中细胞色素C蛋白的相对表达量分别0.15、0.15和0.44,表现为F10沉默实验组中细胞色素C蛋白的相对表达量显著升高。Bcl-2 mRNA蛋白的相对表达量分别为:0.40、0.41和0.11。从KLE细胞的0.4到F10沉默实验组的0.11,F10沉默实验组细胞克隆中Bcl-2表达下调达64%。三小结以F10基因表达稳定下调的KLE细胞克隆为模型,深入探讨F10基因沉默对KLE细胞凋亡的影响及机制。1、F10沉默的细胞克隆中BCL-2表达下调,说明线粒体途径参与了F10基因沉默诱导的细胞凋亡的机制。2、F10基因沉默诱导细胞凋亡的可能机制:细胞色素C的释放是F10沉默诱导KLE细胞凋亡的途径之一。全文结论1、体外转录制备针对F10基因的dsRNA能特异有效沉默KLE细胞中的F10基因。2、F10基因的沉默可诱导KLE细胞的凋亡。3、通过在F10基因沉默载体基础上,成功建立了F10基因表达下调的稳定细胞克隆4、F10沉默的细胞克隆中BCL-2表达下调,提示线粒体途径参与了F10基因沉默诱导的细胞凋亡的机制。5、细胞色素C的释放提示是F10沉默诱导KLE细胞凋亡的途径之一。