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睡眠受昼夜节律和内稳态因素的调控。腺苷是重要的内源性促眠物质,腺苷受体(Receptor, R)有四种亚型：A1R、A2AR、A2BR和A3R,大量研究显示：A1R和A2AR介导腺苷的促眠效应。研究表明：腺苷可通过A1R抑制基底前脑胆碱能神经元、结节乳头体核(TMN)组胺能神经元、和／或下丘脑外侧部orexin能神经元,促进睡眠。但全身或脑室内给予A1R激动剂对睡眠觉醒周期无明显影响；A1R基因剔除小鼠在基础状态和睡眠剥夺后,均无明显的睡眠异常。因此我们推测,腺苷作用呈现脑区依赖性,可能激活某些脑区的A1R,抑制睡眠。下丘脑腹外侧视前区(VLPO)是重要的睡眠中枢,我们推测激活VLPO区A1R可能抑制睡眠中枢,促进觉醒,抵消脑内给药抑制觉醒系统引起的睡眠。本研究利用高度自动化睡眠觉醒生物解析系统,结合药理学、免疫组织化学方法和A1R基因剔除小鼠,研究VLPO区A1R对自发性睡眠-觉醒及内稳态睡眠调节的作用及机制。方法1.利用高度自动化睡眠觉醒生物解析系统,在VLPO区埋置导管,手术恢复后,通过局部微注射方式给药,研究腺苷,A1R激动剂(CPA)、拮抗剂(CPT)及A2AR激动剂(CGS21680)、拮抗剂(MSX-3)对大鼠和小鼠基础状态下睡眠-觉醒行为的影响。2.通过睡眠剥夺方式,结合脑电记录及微注射方法,研究VLPO区A1R是否参与睡眠内稳态调节。3.通过Fos蛋白免疫组化染色方法,研究A1R在VLPO区对自发性睡眠-觉醒调节作用分子机制。4.免疫组化染色方法,检测不同睡眠张力下,VLPO区A1R的表达。研究结果基础状态下,腺苷A1R和A2AR在VLPO区对睡眠-觉醒的作用及分子机制研究1.大鼠双侧VLPO区内给予0.17、0.5或1.5nmol/side腺苷A1R激动剂CPA剂量依赖性地减少非快动眼(Non-rapid eye movement, Non-REM, NREM)和快动眼(REM)睡眠,促进觉醒,大剂量作用维持时间达2小时,且CPA能即刻产生促觉醒效应,并使动物在给药后一个半小时内处于完全觉醒状态,提示VLPO区A1R参与了觉醒的诱导。2.大鼠VLPO区内给予6、18.5或55pmol/side腺苷A1R拮抗剂CPT能显著增加NREM睡眠,减少觉醒量,对REM睡眠有增加趋势,但无统计学差异。不同剂量CPT促眠作用维持时间均为5小时。VLPO区给予55pmol/side CPT后,短时程NREM睡眠(持续时间<64秒)出现次数增多,微小觉醒(持续时间<16秒)增多,而长时程NREM睡眠和觉醒的出现次数并未发生变化,导致NREM睡眠及觉醒总的发生次数增加,觉醒平均持续时间缩短。NREM睡眠到觉醒,觉醒到NREM睡眠,以及REM睡眠到觉醒的转换次数也分别增加。此外,NREM睡眠Delta波活动在0.75-3.25Hz频率段增强,睡眠深度增加。生理状态下阻断VLPO区A1R后,睡眠量及深度均增加,且增加的睡眠呈现明显的片段化,微小觉醒增多,提示动物维持觉醒困难,表明VLPO区内A1R参与了生理性睡眠觉醒的调节,并在觉醒维持中起重要作用。3.野生型小鼠VLPO区内给予0.3nmol/side CPA可以减少NREM和REM睡眠,增加觉醒量,作用维持时间为1小时；而在A1R基因剔除小鼠则未能引起睡眠觉醒的改变,说明CPA对A1R的激动具有高度特异性。4.大鼠VLPO区内分别给予6、55或500pmol/side A2AR激动剂CGS21680能剂量依赖地增加NREN和REM睡眠,减少觉醒量。大剂量(500pmol/side)CGS21680促眠作用维持时间为5小时。VLPO区给予CGS21680(500pmol/side)后睡眠觉醒各参数变化情况如下：NREM和REM睡眠总发生次数增加,觉醒平均持续时间缩短。不同持续时间片段的NREM和REM睡眠(包括短时程和长时程)的发生次数均有不同程度的增加,而导致长时程觉醒片段的发生次数减少,短时程觉醒片段发生次数增加。除NREM睡眠到REM睡眠转换次数增加外,其他各时相之间的转换次数均未发生改变。NREM睡眠Delta频率段的波谱能量强度没有变化。这些结果表明激活VLPO区内A2AR诱导的睡眠与生理性睡眠相似,提示VLPO区可作为临床上治疗某些睡眠障碍疾病的潜在靶位。5.大鼠VLPO区内分别给予5或10nmol/side A2AR拮抗剂MSX-3对睡眠觉醒特征无明显影响,提示VLPO区A2AR在生理情况下不参与睡眠觉醒的调节。6.大鼠VLPO区内分别给予0.5、1.5或4.5nmol/side腺苷对睡眠觉醒特征无明显影响,可能是由于腺苷同时激活了A1R和A2AR,二者作用相互抵消所致。7.Fos蛋白免疫组化研究显示:VLPO区给予CPA1.5nmol/side,脑内蓝斑(LC)、导水管周围灰质腹外侧部(VLPAG)、TMN活性增加,并在皮层有大量Fos蛋白表达。这些结果表明：生理情况下,VLPO区A1R的促觉醒作用,与觉醒核团LC、VLPAG和TMN有关。8.荧光免疫染色表明：VLPO区有腺苷A1R表达,但表达水平较低；睡眠剥夺后,A1R表达水平增加,可能与防止动物睡眠剥夺后的过度睡眠有关。睡眠剥夺后,VLPO区A1R对睡眠内稳态的调节6小时睡眠剥夺后,VLPO区给予溶剂或A1R激动剂1.5nmol/side CPA,发现与对照组相比,CPA能显著减少夺眠之后的睡眠反弹,即减少NREM和REM睡眠,增加觉醒量,作用维持时间为2小时；NREM和REM睡眠入睡潜伏期延长；NREM睡眠delta波谱能量强度减弱,睡眠深度减低。反之,6小时睡眠剥夺后给予A1R拮抗剂55pmol/side CPT,与对照组相比,在给予CPT后第2小时,睡眠剥夺后的睡眠反弹量增加(NREM睡眠增加,而REM睡眠无明显变化),觉醒量减少,提示VLPO区A1R在睡眠内稳态调节中发挥重要作用。由于睡眠剥夺后,VLPO区A1R表达水平增高,结合睡眠剥夺行为学数据,我们认为,睡眠剥夺增加的A1R与防止过度睡眠有关。小结1.生理状态下,VLPO区A1R参与觉醒的诱导和维持。2.激活VLPO区A1R后,觉醒增加。觉醒相关脑区LC、VLPAG和TMN可能参与这一作用。3. VLPO区A1R参与了睡眠内稳态调节,防止睡眠剥夺后VLPO神经元的过度活化,即防止过度睡眠。4. VLPO区A2AR在生理情况下不参与睡眠觉醒的调节。5. VLPO区有腺苷A1R受体的低水平表达,睡眠剥夺后表达水平升高。