新型鹅星状病毒（N-GAst V）是近年来新发现的一种病原,主要引起患病雏鹅的内脏和关节痛风。雏鹅感染后常在5～20日龄发病,死亡率可高达50%,给我国养鹅业带来了严重的经济损失。为进一步明确雏鹅感染新型鹅星状病毒后的组织损伤以及不同时间点主要组织器官的抗原分布及定位情况,开展了如下研究:1、新型鹅星状病毒免疫组化检测方法的建立本研究首先复苏了实验室保存的能稳定分泌新型鹅星状病毒ORF 2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,诱导小鼠产腹水并纯化,WB和IFA鉴定表明,该腹水能与新型鹅星状病毒ORF 2蛋白特异性结合。经检测,腹水的效价可达1:102,400。利用制备的腹水为一抗,通过对免疫组化程序中抗原修复时间、过氧化物酶封闭时间、一抗反应条件、二抗反应条件、显色底物作用时间等多个试验条件进行反复摸索和优化,确定了单抗介导免疫组化检测方法的最佳反应条件,即微波修复7 min、3%H2O2孵育20 min、一抗稀释1,000倍4℃冰箱中过夜孵育、二抗稀释500倍37℃温箱中孵育1 h、DAB湿盒孵育8 min,最终成功建立了新型鹅星状病毒的免疫组化检测方法。2、新型鹅星状病毒对雏鹅组织损伤特性的研究利用鸡胚肝细胞培养实验室分离保存的新型鹅星状病毒SDTZ株,通过RT-PCR鉴定其纯净性,并测定病毒TCID50=10-4.9/0.1 m L,大量增殖后保存至-80℃备用。将120只1日龄健康雏鹅随机分为3组,A组腿肌注射攻毒0.3 m L/只,B组口服攻毒0.3 m L/只,C组作为对照组肌肉注射生理盐水0.3m L/只,连续观察24 d。在12 hpi、1 dpi、3 dpi、5 dpi、7 dpi、9 dpi、12 dpi、15 dpi、18 dpi、21 dpi及24 dpi,记录各组体重和发病死亡情况,每组随机剖杀3只,分别取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、法氏囊、胸腺、胰腺、腺胃、十二指肠、大脑及延髓组织,用4%多聚甲醛溶液固定24 h,制备石蜡切片,进行HE染色,观察其病理组织学变化。结果显示,攻毒组雏鹅出现精神沉郁、采食下降等临床症状,死亡雏鹅心脏、肝脏表面有尿酸盐附着、沉积,肾脏肿大、出血呈花斑状,输尿管有尿酸盐沉积。攻毒组雏鹅的体重较对照组增长缓慢,以肌内攻毒组最为显著。HE染色结果显示,两组攻毒雏鹅的组织学病变基本一致,主要表现为心脏心肌纤维水肿,间质增宽,有少量红细胞和炎性细胞浸润;肝脏肝细胞脂肪变性、空泡变性;肾脏肾小球肿胀,部分肾小管上皮细胞坏死、脱落;脑血管周围形成淋巴细胞围成的血管套。3、新型鹅星状病毒感染靶细胞的鉴定应用所建立的免疫组化方法对新型鹅星状病毒抗原进行检测,结果显示,新型鹅星状病毒广泛存在于心脏心肌细胞;肝脏肝细胞;脾脏中央动脉周围的淋巴细胞和白髓内的淋巴小结;肺脏支气管、呼吸毛细管和肺房内衬的扁平上皮细胞以及立方上皮细胞;肾脏近曲小管、远曲小管和集合管的上皮细胞;法氏囊滤泡髓质部的淋巴细胞;胸腺小叶髓质部的网状细胞;胰腺胰岛内的B细胞和D细胞;大脑和延髓的神经元细胞;腺胃复管腺的腺细胞和腺胃粘膜的柱状上皮细胞;十二指肠肠腺的柱状细胞、潘氏细胞中。且阳性信号显示,N-GAst V主要定位于细胞质中。两攻毒组在攻毒12 h后就能在心脏、肝脏、肺脏、肾脏内检测到阳性信号。肌注组脾脏、胸腺在攻毒后12 h即可检测到阳性信号,而口服组脾脏、胸腺则在攻毒后1 d方能检测到阳性信号。口服组腺胃和十二指肠在攻毒12 h后检测到阳性信号,而肌注组则在攻毒后1 d检测到阳性信号。两组雏鹅胰腺在攻毒后1 d出现阳性信号,法氏囊在攻毒后3 d出现了阳性信号,大脑和延髓在攻毒后7 d出现阳性信号。在攻毒后21 d,两组法氏囊、胰腺、大脑和延髓均检测不到阳性信号。在攻毒后24 d,两组胸腺和脾脏均检测不到阳性信号。雏鹅感染后第7 d到12 d染色强度明显高于其他日龄,其中肾脏染色强度最高。综上所述,本研究利用所建立的新型鹅星状病毒免疫组化检测方法,对经肌注和口服两种方式感染的1日龄雏鹅进行了抗原定位分析。结果显示,感染初期大部分组织器官快速受到侵害,感染后7 d～12 d病毒的组织分布最广泛;病毒主要分布于各类型细胞的细胞质中;雏鹅感染后第7～12 d染色强度最高,其中肾脏最为明显,从而证明新型鹅星状病毒具有广泛的组织嗜性,肾脏是其主要靶器官,本研究为进一步阐明新型鹅星状病毒的致病机制提供了一定的科学依据。