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第一部分肌肉内血管畸形组织病理研究及MMP-9和磷酸化Tie2的表达目的明确肌肉内血管畸形(IMVM)病理特点并检测组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及磷酸化的Tie2(P-Tie2)的表达,分析临床表现与病理改变之间的相关性,探讨其意义。方法收集临床肌肉血管畸形标本39例、正常颅面部皮下组织标本10例;采用H.E.染色观察IMVM病理组织形态学改变,ABC免疫组化染色检测MMP-9、P-Tie2的表达。图像分析软件比较染色强度变化。结果IMVM病理镜下表现为大小不一的畸形血管腔聚集成团或散落在肌间生长,管壁厚薄不均,可见内皮细胞排列紊乱,伴脂肪组织存在,部分管腔内血栓机化再通,新生毛细血管样结构可长入。MMP-9、P-Tie2在肌肉内血管畸形组织中的阳性表达远高于正常皮下组织中的表达,差异具有统计学意义(P＜0.01);其表达的强度在不同病程、部位、瘤体大小及浸润程度的病例中无明显差异(P＞0.05)。结论IMVM的病理基础来自其畸形管腔的形态学变化及构成细胞的异常表现;MMP-9、P-Tie2可能参与IMVM的发生、发展,可以成为相对特异性的病理学诊断参考。第二部分肌肉内血管畸形血管内皮细胞培养、鉴定和生物学行为研究目的探讨并建立人肌肉内血管畸形内皮细胞(IMVM-EC)体外分离培养的方法;研究IMVM-EC形态、表型和生长、运动、凋亡等生物学行为的特点;比较IMVM-EC同正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的差异。方法收集IMVM手术切除后病理组织,运用组织贴壁法培养IMVM-EC,刮除杂细胞进行细胞纯化;收集人剖腹产术后脐带组织,运用Ⅰ型胶原酶消化法培养HUVEC;相差显微镜下观察比较细胞生长过程和形态学改变;细胞免疫荧光和化学染色鉴定两种内皮细胞表面抗原FVⅢ-Ag、CD31、VEGFR、磷酸化的VEGFR(P-VEGFR)、PDGFR、磷酸化的PDGFR(P-PDGFR)的表达;MTT法测定IMVM-EC的生长曲线;将细胞接种于鼠尾胶原观察其管腔形成能力;划痕实验和Transwell实验检测内皮细胞的迁移和侵袭能力;乏血清培养诱导细胞的凋亡模型,流式细胞仪检测不同种细胞的凋亡率。结果IMVM组织块贴壁3-5天后有EC爬出生长,原代培养3周左右可长满25cm~2培养瓶,呈典型的“铺路石”样细胞形态。IMVM-EC传代后3-6天为对数生长期,有自发性管腔形成现象,4代后开始老化。两种EC皆表达阳性CD31和FVⅢ-Ag。部分血管新生相关的抗原——VEGFR、P-VEGFR、PDGFR、P-PDGFR在IMVM-EC中阴性表达;在HUVEC中弱阳性表达。IMVM-EC和HUVEC具有相似的体外管腔形成能力。IMVM-EC较HUVEC具有增强的细胞迁移能力,且具有突破Matrigel胶模拟的细胞外基质而侵袭生长的能力。IMVM-EC较HUVEC在血清剥夺诱导的调亡模型中凋亡率下降(P＜0.05)。结论IMVM-EC原代细胞培养模型可以通过组织贴壁法于体外顺利建立。其培养的关键是分辨管腔内皮面种植,刮除杂细胞进行细胞纯化,添加生长因子促进内皮细胞优势性生长。对比HUVEC,IMVM-EC细胞学的异常表现包括:表面部分抗原缺失,管腔形成能力、迁移侵袭能力和对抗凋亡能力增强。IMVM-EC表型和生物学行为的异常是IMVM病理性发生发展的基础之一。第三部分肌肉内血管畸形侵袭和凋亡相关的分子机制研究(一) IMVM病理组织中MMP-9、P-tie2的基因和蛋白表达目的从基因转录和蛋白表达层面检测IMVM组织中MMP-9、P-tie2(Tyr992)的表达,验证两者和IMVM病理学发展的相关性。方法收集临床手术切除的IMVM病理组织,以正常皮下组织为对照组,通过RT-PCR和Western Blot的方法检测各组织中MMP-9、P-tie2的基因和蛋白表达,以上样标本中的β-actin为内参照,获得灰度比值,统计学比较各组间差异。结果IMVM组织(n=17)中MMP-9和磷酸化的Tie2的mRNA表达较正常对照组(n=7)明显增高,差异具有统计学意义(P＜0.05);不同部位、治疗次数的MMP-9和Tie2 mRNA的均值比较无明显统计学差异。17例IMVM组织中有13例P-tie2和15例MMP-9的蛋白表达阳性,9例对照组中1例MMP9和P-tie2蛋白表达阳性,其阳性率比较有统计学差异(P＜0.05)。结论MMP-9和P-Tie2参与IMVM组织病理学改变。(二) IMVM-EC中MMP-9、P-tie2的基因和蛋白表达和相关信号传导旁路PI3K/Akt的研究目的从基因转录和蛋白表达层面研究人IMVM细胞中MMP-9、P-tie2(Tyr992)和信号传导通道PI3K/Akt的表达和改变;探讨和IMVM侵袭性发展及凋亡相关的病理学机制。方法在成功分离和培养IMVM-EC的基础上,运用组织贴壁法培养IMVM来源的血管平滑肌细胞(VSMC)。以IMVM-EC为实验组,VSMC和HUVEC为对照组;乏血清培养诱导内皮细胞凋亡,通过RT-PCR检测不同组内皮细胞中MMP-9和P-tie2的基因表达,统计学分析各组差异。使用药物LY294002和SU11248处理内皮细胞,观察细胞生长改变,Western Blot检测各组细胞中MMP-9、P-tie2、Akt、P-Akt表达的变化,统计学分析比较其差异。结果IMVM-EC中MMP-9和Tie2的mRNA表达较HUVEC增高,凋亡组和正常组之间表达有差异(P＜0.05)。IMVM来源的VSMC不表达MMP-9和P-tie2蛋白。所有内皮细胞都不同程度地表达Akt蛋白;IMVM-EC正常组和凋亡组表达P-Akt(Ser473),HUVEC阴性表达。PI3k抑制剂LY294002可以阻断IMVM-EC中Akt发生磷酸化,但不阻断P-tie2的表达。抗血管生成药物SU11248随作用浓度增大而下调IMVM-EC和HUVEC表面酪氨酸激酶受体-Tie2的磷酸化表达,并诱发内皮细胞脱壁死亡。结论高磷酸化的Akt(Ser473)表达和IMVM-EC病理性行为有一定关系。磷酸化的Tie2可能通过活化内皮细胞内信号传导旁路PI3k/Akt来增强IMVM-EC的抗凋亡能力。IMVM-EC通过高表达MMP-9来介导自身增强的侵袭能力。MMP-9抑制剂和特异性的酪氨酸激酶抑制剂有可能成为IMVM生物学治疗的新方向。(三) P-Akt在IMVM病理组织中的免疫组化研究目的检测IMVM组织中P-Akt的表达;验证P-Akt和IMVM病理发展的相关性。方法以正常皮下组织作为对照组,收集IMVM临床病理标本,免疫组化ABC法检测P-Akt的表达;镜下观察对比染色强度的变化,统计学比较阳性率。结果免疫组织化学染色示39例病理标本中15例阳性表达P-Akt,对照组10例全阴性表达,阳性率比较有统计学差异(P＜0.05)。结论磷酸化的Akt和IMVM组织病理学发展有一定的相关性。