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Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是近年来发现的一类新的天然免疫受体,它能够特异性地识别侵入的病原微生物,通过偶联信号转导途径,激活天然免疫细胞,最终引起一系列的炎症反应。TLRs不仅能激活天然免疫系统,而且也为激活获得性免疫提供共刺激信号。目前已经确认发现了13种TLRs,在机体中分布广泛,大约20余种细胞表面均有表达。现在己经在鸡的多种组织、分离的免疫细胞和培养细胞中确定了9种鸡的TLRs (ChTLRs).本研究旨在以IBDV感染模型,探索在IBDV疫苗免疫过程中chTLRs参与免疫反应的机制,寻找在该病毒感染中介导信号传导的主要TLRs。在此基础上,通过外源物质调节该chTLRs,应用于IBDV疫苗中,希望能够增强疫苗的免疫效果。1海兰褐蛋鸡体内To|｜受体类型的研究在本研究中,根据已报道出来的鸡的9种Toll样受体(TLR)的11个基因序列,设计特异性引物,从海兰褐蛋蛋鸡体内扩增出11个鸡Toll样受体部分基因片段,与GenBank已发表序列比对,同源率达100%。同时根据人TLR9、鼠TLR9、猪TLR9基因序列设计引物,从鸡总cDNA中扩增鸡TLR9,最后结果发现鸡体内不存在TLR9。2chTLR3、chTLR7和chTLR21荧光PCR检测方法的建立本试验旨在建立检测chTLR3、chTLR7、chTLR21mRNA的荧光定量检测方法。以上一章构建好的重组质粒PMD19-T-pchTLR3、PMD19-T-pchTLR7、 PMD19-T-pchTLR21为标准模板,设计合成3对特异的引物,对反应条件进行了优化,建立了检测chTLR3、chTLR7、chTLR21mRNA的荧光定量标准曲线,并对其进行方法学评价。所建标准曲线各参数均符合要求,chTLR3和chTLR7敏感度检测为100拷贝/ul, β-actin和chTLR21为10拷贝/ul,各曲线具有良好的重复性和稳定性。3IBDV中强毒株感染鸡后chTLR3、chTLR7和chTLR21mRNA表达的动态变化通过IBDV中强毒株感染鸡后,检测鸡法氏囊和脾脏内TLR3mRNA、TLR7mRNA、 TLR21mRNA表达的动态变化,分析这些受体在病毒早期感染中的作用。将40只14日海兰褐蛋鸡随机分成两组：对照组10只鸡；实验组30只鸡。实验组接种IBDV活疫苗(CEVAC(?)IBDL,W2512株)2羽份／只,对照组注射生理盐水,隔离饲养。在免疫前和免疫后12h、24h、48h、72h、130h各时间点每组分别断颈处死5只鸡,取脾脏和法氏囊分离淋巴细胞并提取总RNA。用建立的实时荧光定量检测方法检测各组中chTLR3、chTLR7、chTLR21表达的动态变化。结果显示,在免疫后36小时,鸡法氏囊和脾脏中chTLR3表达变化最显著,在免疫后48小时,鸡脾脏和法师囊中TLR21表达变化也较为明显,但是没有chTLR3变化显著,在整个免疫时间段内,两种组织中chTLR7表达变化不显著。4体外polyl:C和CpG对chTLR3mRNA表达的影响本章试验通过体外试验评价polyl:C和CpG对chTLR3mRNA表达的影响。无菌提取鸡外周血淋巴细胞,调整细胞浓度为106/ml,以6ml/孔铺于6孔细胞板。将polyI:C和CpG添加到细胞培养液,使其终浓度分别为100ug/ml和50ug/ml,各浓度设置2个重复孔,同时设置对照组,置于37℃5%C02细胞培养箱中培养24h。并在佐剂添加前和添加后3h、6h、9h、12h、24h收集淋巴细胞,提取淋巴细胞中的总RNA进行RT-PCR反应。以第二章试验所建的实时荧光定量检测方法检测各组细chTLR3mRNA的表达量。结果显示,polyl:C组在培养3个小时时chTLR3mRNA表达量最高,CpG组chTLR3mRNA表达量在添加CpG后表达量受抑制,此结果说明polyI:C是chTLR3特异性配体,并且能够刺激chTLR3mRNA表达。5Polyl:C对IBDV活疫苗的免疫影响将30只14日龄海兰褐蛋鸡分成三组：对照组、IBDV疫苗组、polyI:C+IBDV疫苗组,每组10只,各组隔离饲养。自免疫之日起,每周采血一次,共采血5次,并分离血清。用IBDV抗体检测试剂盒检测抗体效价。免疫5周后,用IBDV BC6/85株进行攻毒,攻毒剂量为100BID50/羽份,攻毒后每天观察鸡只状态和死亡情况,第4天全部处死,解剖观察病变。结果显示,添加佐剂组的抗体与疫苗免疫对照组抗体水平相当,攻毒保护率高10%,但差异不显著(P<0.05)。