昆虫病原真菌是指某些类群即能够在寄主正常的生理条件下直接侵入其体内、增长繁殖并很快引起死亡。该菌的生活方式多样,以腐生、寄生、根际定植为主。目前,在这类真菌中以研究白僵菌和绿僵菌较为常见。绿僵菌具有容易培养及广泛的昆虫宿主特性,现已普遍应用于蝗虫、柑桔吉丁虫等生物防治中。可变剪接作为调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制,能够使某些单个基因产生多个mRNA变体,是导致真核生物基因和蛋白质较大差异的重要原因。尽管可变剪接在高等生物中研究较为广泛,但在昆虫病原真菌中的研究较为缺乏。作为重要虫生真菌中的一员,罗伯茨绿僵菌转录组方面的可变剪接研究甚少。为了进一步了解可变剪接对不同生活环境下罗伯茨绿僵菌的影响,我们从多种培养条件入手,以获得较为全面的转录组测序数据,最终从转录组水平挖掘可变剪接的具体数据。本项目以罗伯茨绿僵菌为研究对象,在各种不同环境下培养,包括生长发育、退化、逆境胁迫、侵染定殖,提取不同阶段所要孢子或者菌丝的RNA,以等浓度同体积混合成样,然后进行RNA-seq测序,得出其可变剪接数据。其次,通过统计学及生物信息学等多重方法分析可变剪接基因的表达差异。最后,通过RT-PCR验证数据可靠性。最终挖掘出罗伯茨绿僵菌转录组中较为详尽的可变剪接数据。具体研究结果如下:1.罗伯茨绿僵菌中超丰富的可变剪接事件:RNA-seq数据鉴定出常见可变剪接事件。所有事件分别属于内含子保留（IR）可变3’剪接位点（A3SS）,可变5’剪接位点（A5SS）,以及外显子跳跃（ES）四种类型。令人惊讶的是10471个可变剪接事件中有多达5005个基因参与。可变剪接基因的占比达到基因总数的47.3%。2.罗伯茨绿僵菌中剪接调控子及其可变剪接事件:数据中显示有64个基因与间接调控子有关。44个编码剪接因子（SF）的基因,7个编码RNA结合蛋白的基因（RBP）,3个编码丝氨酸精氨酸（SR）蛋白基因,以及10个编码snRNPs和snRNPs-like蛋白基因。通过BLASTnr,其中E-value<2E-53的12个基因与其他真菌物种中的剪接调控子具有序列同源性。对比与米曲霉,罗伯茨绿僵菌中U2AF蛋白家族基因的mRNA变体较多,表明可变剪接事件的频率可能与基因结构有紧密联系。3.与毒力相关的蛋白酶基因发生的可变剪接事件:蛋白酶家族中,枯草杆菌蛋白酶家族基因有30个表达,基因组数据中显示的是55个。而胰蛋白酶中只有不到三分之一的基因在我们数据中表达。正好有一半的枯草杆菌蛋白酶家族基因发生可变剪接事件。其中基因MAA₀4783不仅有两个A3SS变体,还有2个IR变体,其余基因全都发生IR事件。构成对比的是,表达的10个胰蛋白酶基因中仅有1个基因发生1次可变剪接事件。由此结果推断,罗伯茨绿僵菌中枯草杆菌蛋白酶家族基因可能较容易发生可变剪接。4.与毒力相关的几丁质酶基因的表达及可变剪接事件:我们的数据里出现了17个几丁质酶基因,NCBI数据库中有其基因26个。然而,通过BLASTP在NCBI中比对,得出约三分之一的表达基因和绿僵菌其他物种具有同源性。其中,有6个基因发生可变剪接。意料之外的是,内含子保留（IR）是这6个基因的共同可变剪接类型,仅MAA₀0983还有一个A3SS事件。在我们统计的这些可变剪接基因发生的11个变体中,MAA₀2685拥有其中最多的3个变体。此外,M.robertsii几丁质酶基因chi2中与序列同源性较高的Metarhizium anisopliae E6菌株中几丁质酶基因chi2发生可变剪接的方式截然不同。前者在第一个内含子位置发生保留,而后者在第二个内含子位置发生保留。5.功能注释及可变剪接基因的分类:可变剪接的基因与组成型剪接的基因分别进行GO功能注释。发现可变剪接基因中大部分基因富集于BP的新陈代谢过程（821）,CC的细胞（439）及细胞部分（439）,MF的催化剂作用（870）。但我们也发现了常规剪接与可变剪接之间存在些许差异。属于MF的酶调控活性仅存在于可变剪接基因中（21基因）。对比于常规剪接中信号基因约占0.98%,可变剪接过程中仅约3.3%。KEGG通路富集分析显示,不同mRNA变体数的基因中拥有较多变体的基因显著富集于MAPK信号通路及泛素介导的蛋白水解酶通路。本研究挖掘出了罗伯茨绿僵菌中较丰富的可变剪接事件,不仅有助于促进人们改变对于低等生物可变剪接基因数量较少的认识,而且也能够进一步了解可变剪接基因与昆虫病原真菌性状的关系,从而为昆虫病原真菌的可变剪接事件提供参照。