论文部分内容阅读
目的 建立人羊膜上皮细胞分离、培养与冻存工艺,研究其基本的生物学特性,并进行人羊膜上皮细胞向肝样细胞分化的研究。方法无菌条件下收集剖宫产新生儿的羊膜,采用正交法对不同的分离、培养与冻存条件设计适宜的因素水平,采用与之相对应的正交表进行试验。以相同质量羊膜所得SSEA-4阳性细胞量为对照,研究胰酶浓度、消化时间与消化次数等影响因素对分离效果的影响；以SSEA-4阳性细胞量/细胞接种量为对照,研究细胞接种密度、血清浓度与细胞生长因子EGF浓度等影响因素对培养效果的影响；以复苏细胞存活率为对照,研究细胞冻存密度、DMSO浓度与血清浓度等影响因素对冻存效果的影响。以此提出优化的人羊膜上皮细胞分离培养与冻存工艺。取原代、传代及冻存复苏细胞做形态学观察,绘制细胞生长曲线,对原代细胞作相关表面标志物的免疫荧光染色,并对原代及P4代细胞作免疫流式细胞检测。取P1代人羊膜上皮细胞向肝样细胞诱导分化,诱导组在5%FBS的DMEM/F12培养液中加入20ng/ml HGF、10ng/ml FGF4、10ng/mlIGF-1、500nM Dex诱导试剂组合,对照组只加入5%FBS的DMEM/F12培养液,诱导周期为三周。镜下对比诱导细胞与对照细胞形态的变化,诱导过程中细胞免疫荧光染色的变化,逆转录与荧光定量PCR检测诱导过程中肝细胞相关基因AFP、ALB、HNF4α与CYP1A2表达量的变化,并对诱导3周后hAECs细胞作糖原染色检测。结果经正交法数据分析得到,优化的胰酶消化羊膜上皮细胞的分离条件为：胰酶浓度0.25%,分4次消化,每次消化时间20min,分离因素影响大小依次为：消化次数>消化时间>胰酶浓度。优化的培养条件为：细胞接种密度为4x105/ml, EGF浓度为10ng/ml,血清浓度为5%,培养因素影响大小依次为：细胞接种密度>血清浓度>EGF浓度。优化的冻存条件为：细胞冻存密度为1×107/ml, DMSO浓度为10%,血清浓度为80%。冻存因素影响大小依次为：DMSO浓度>细胞冻存密度>血清浓度。原代接种细胞2-3d内下沉贴壁生长,贴壁后呈扁平不规则多角形,以铺路石样生长。传代后细胞贴壁与生长速度加快,冻存复苏的P2代细胞生长与扩增能力无明显下降。免疫荧光染色显示,原代细胞强表达CK19、SSEA-4,不表达Vimentin、CD45和HLA-DR。统计原代及P4代细胞流式检测数据,P4代细胞中SSEA-4与CK19免疫阳性细胞百分率较原代细胞有显著减少(P<0.0001);而Vimentin和CD105较原代细胞有显著增加(P<0.0001)；P4代与原代细胞的CD73免疫阳性细胞百分率均很高,且无显著性差异(P=0.162>0.05)；HLA-DR在原代或P4代细胞中均不表达。人羊膜上皮细胞诱导2周后,细胞由椭圆形逐渐向多角扁平形状转变,细胞折光性增加。经免疫荧光染色显示,诱导1周后AFP表达量大,但3周后有明显下降；诱导3周的ALB和CK18的表达量均较1周的有明显增加；而SSEA-4的表达量逐渐减弱。荧光定量PCR采用2-Δ△ct法对各基因进行相对定量显示,诱导1周后人羊膜上皮细胞的AFP相对表达量显著大于诱导前(P<0.05),诱导3周后,AFP相对表达量又显著降低(P<0.05)；诱导3周后,ALB、HNF4α和CYP1A2三种基因的相对表达量均显著大于诱导前(P值均小于0.05)。结论建立了人羊膜上皮细胞分离、培养与冻存的优化工艺。人羊膜上皮细胞易于获得且体外增殖能力强,表达胚胎干细胞保持未分化状态的表面标志物。体外可诱导向肝样细胞分化,表达肝细胞特异性基因,具备肝细胞特有功能特征,有望成为干细胞治疗终末期肝病良好的细胞来源。