水仙类胡萝卜素合成途径基因的表达及花色相关基因克隆

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水仙(Narcissus)是石蒜科水仙属多年生草本植物,常见有喇叭水仙(Narcissuspseudonarcissus L.)、中国水仙(Narcissus tazetta var. chinensis)等,中国水仙是多花水仙(Narcissus tazetta)的变种。漳州水仙中类胡萝卜合成途径相关基因的表达,分析水仙花瓣和副冠颜色形成与类胡萝卜素合成结构基因表达之间的关系;同时,克隆花色相关基因CHRC、MYB和BCH,研究了CHRC基因的表达;构建BCH反义植物表达载体进行转化中国水仙的初步研究,为探究水仙花色形成分子机制及遗传改良奠定基础。主要研究结果如下:1.利用RT-PCR和qRT-PCR研究结构基因PSY、PDS、ZDS、LYCE、LYCB和BCH在三个水仙品种中的表达情况,分析水仙花瓣和副冠颜色形成与类胡萝卜素合成相关基因表达之间的关系,结果表明:同一水仙品种花瓣和副冠间各基因的表达量十分接近,推测花瓣呈白色可能与结构基因的转录水平无关;‘粉红魅力’橙红色副冠中PSY、PDS、LYCB、ZDS的表达量比漳州水仙黄色副冠高,而LYCE和BCH基因表达量下降,说明红色副冠累积β-胡萝卜素是多个结构基因共同作用的结果;‘嘹亮’橙黄色副冠中BCH的表达量显著高于漳州水仙的黄色副冠。2.利用RT-PCR和RACE技术从漳州水仙副冠中克隆得到CHRC基因的全长cDNA,共有1391bp,其中开放阅读框序列有951bp,编码316个氨基酸,5′非编码区有115bp,3′非编码区有325bp。经过NCBI网站BLAST分析,漳州水仙CHRC基因的氨基酸序列与柑橘、水稻、番茄和文心兰CHRC基因的同源性分别为73%、73%、70%和70%。利用半定量RT-PCR研究CHRC基因在漳州水仙全开时期的白色花瓣、黄色副冠,及叶片和鳞茎中的表达,与在‘粉红魅力’全开时期的白色花瓣和红色副冠中的表达。结果表明:CHRC基因在‘粉红魅力’红色副冠和漳州水仙黄色副冠中均有较高的表达,且在红色副冠中的表达量显著高于黄色副冠;漳州水仙的鳞茎中也有表达,而漳州水仙白色花瓣、叶片和‘粉红魅力’的白色花瓣中CHRC的表达极弱,表明水仙花色的形成还与类胡萝卜素在有色体中的累积有关。3.以洋水仙‘粉红魅力’花瓣总RNA逆转录产物为模板,设计R2R3-MYB保守区简并引物进行PCR扩增,获得2个长分别为332bp和333bp MYB转录因子片段,分别命名为NpMYB1、NpMYB2。利用3′RACE技术获得NpMYB2的3′端序列。NpMYB1保守区与白花紫露草、矮牵牛、拟南芥、长筒石蒜和石斛兰的同源性分别达93%、92%、92%、91%和92%;NpMYB2基因的氨基酸序列与丹参、矮牵牛、拟南芥、白花子路草和石斛兰的相似度为77%、74%、67%、68%和68%。4.利用RT-PCR技术从漳州水仙黄色副冠中克隆得到BCH基因的cDNA全长序列。将pC1301载体中的GUS基因切除,反向导入BCH基因,构建反义植物表达载体。利用已优化的体系,通过农杆菌介导转化中国水仙花葶,获得抗性小鳞茎。
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