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运动是无创性心血管疾病预防的重要手段,它能够引起血流剪切力幅值和频率的改变,并且这种改变与运动强度相关。位于血管壁最内层的内皮细胞能够识别不同的血流剪切力信号,并将该机械力信号传递到细胞内部,从而引起一氧化氮(nitric oxide,NO)和活性氧类(reactive oxygen species,ROS)等血管活性物质分泌量的改变,这些活性物质与血管内皮细胞功能以及血管稳态密切相关。尽管大量在体研究表明血流剪切力在运动调节内皮功能中起关键作用,但是不同强度运动所引起的剪切力信号对血管内皮功能的调控规律及其力学生物学机制尚未阐明。鉴于体外系统能够有效模拟动脉内剪切力环境且适用于监测细胞生物学响应,本论文以运动前后人体颈总动脉处的血流剪切力波形为依据构建运动剪切力体外模拟系统,研究不同强度运动诱发的剪切力对于血管内皮细胞中NO和ROS水平的影响以及相关的力学生物学机制,为合理运动强度的选择以及心血管疾病的预防提供一定的可能性。主要研究内容和成果如下:(1)基于实测数据与血流动力学建模方法,获取了不同强度运动前后颈总动脉处的血流剪切力波形及其特征。利用彩色超声多普勒仪及电子血压计分别测量了静息、中等强度(55%最大心率)和高等强度(75%最大心率)运动后1 1名受试者颈总动脉处的轴心流速和管径波形以及肱动脉处的心率和血压;基于上述所测得的血流动力学参量,分别利用刚性管和弹性管模型计算得到了静息、中等和高等强度运动后的剪切力波形。研究结果不仅证实了动脉管壁的弹性形变在血流剪切力波形计算中的必要性,而且表明随着运动强度的增加,剪切力的幅值和频率同时增加。(2)构建了矩形和非矩形平行平板流动腔系统,在体外模拟运动前后颈总动脉处具有前后双向振荡特征的脉动流剪切力波形。依据运动前后基于弹性管模型所获得的颈总动脉处剪切力波形,发展了能产生双向振荡流动现象的五元件集中参数血流动力学模型;然后通过数值拟合确定了该模型中各元件的参数值;最后根据各元件的参数值,选用能够模拟顺应性、流体惯性以及流体阻力的元件,搭建了能有效模拟中等和高等强度运动前后颈总动脉处血流剪切力波形关键特征的多元件平行平板流动腔系统。系统中的关键部分平行平板流动腔分为矩形和非矩形两种结构。矩形流动腔底部可以产生大小均一的剪切力波形,利于后续进行特定幅值和频率剪切力刺激后细胞蛋白的收集;而非矩形流动腔底部可产生一定幅值范围的剪切力波形,便于同时进行不同幅值、相同频率剪切力波形作用下细胞响应的研究,有效地提高了实验效率。(3)阐明了不同强度运动剪切力作用下细胞内NO和ROS的响应规律及其相互作用。基于本论文所构建的非矩形流动腔系统,研究了三种幅值(低、中、高)或/和三种频率(1.3 Hz、1.8 Hz、2.5 Hz)两两组合的剪切力波形作用下内皮细胞中NO和ROS的动态响应及其相互作用。实验结果表明,单独剪切力幅值或频率的增大均能够引起细胞内NO和ROS水平的增高;当剪切力幅值和频率同时增大时,细胞内ROS的水平持续升高,而NO则在1.8 Hz、中等幅值剪切力(中等强度运动)作用下水平最高,随着剪切力幅值和频率的继续增大(高等强度运动)其水平反而降低。实验结果同时表明,中等强度运动剪切力所引起的适量ROS的生成有助于NO的生成,而高等强度运动所引起的更高水平的ROS产生则能够在一定程度上降低细胞内NO的生成。(4)揭示了自噬在不同强度运动剪切力作用下细胞内NO和ROS生成中的关键作用。为了进一步明确内皮细胞中NO和ROS生成的力学生物学机制,基于本论文所构建的多元件矩形流动腔系统,研究了自噬在一氧化氮合酶(endothelial NO synthase,eNOS)磷酸化以及NO和ROS生成中的作用。在运用Western Blot法对自噬相关蛋白进行检测并运用mRFP-EGFP-LC3质粒对自噬体的形成和降解进行示踪后发现,静息、中等和高等强度运动剪切力作用下的自噬水平、eNOS Ser1177位点的磷酸化水平和NO生成水平的变化趋势基本一致,均表现出在中等强度运动剪切力作用下其表达或生成水平最高。在运用自噬的抑制剂氯喹进行预处理以后,细胞内eNOS Ser1177的磷酸化水平和NO的量均出现了显著性降低,而在运用自噬的激活剂雷帕霉素进行预处理后,eNOS Ser1177的磷酸化水平和NO的量均出现了显著性增加,表明自噬能够通过eNOS Ser1177的磷酸化上调不同强度运动剪切力作用下NO的生成。另外,在运用自噬的抑制剂或激活剂分别对细胞进行预处理后发现ROS的水平出现了显著性升高或降低,表明自噬能够抑制不同强度运动剪切力作用下细胞内ROS的生成。综上,本论文构建的多元件矩形和非矩形平行平板流动腔系统能够为研究不同强度运动剪切力作用下的细胞响应及机制提供可靠有效的实验平台;本论文不仅从细胞力学生物学角度揭示了中等和高等强度运动对血管内皮细胞功能的影响,而且为选择合理的运动强度以预防和改善心血管疾病提供了一种可能性。