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目的: 1.分析2011年~2015年间温州医科大学附属第一医院临床尿液标本中分离的大肠埃希菌对磷霉素及其他抗菌药物耐药现状,为临床控制大肠埃希菌感染及其抗菌药物的合理使用提供指导。 2.进一步探讨磷霉素耐药大肠埃希菌耐药机制及其流行特性,为合理使用磷霉素、预防耐药菌的产生和播散、保护磷霉素敏感性提供理论依据。 方法: 1.回顾性分析2011-2015年间温州医科大学附属第一医院临床尿液标本分离的大肠埃希菌对临床常用抗菌药物的敏感性。琼脂稀释法检测磷霉素的最低抑菌浓度(Mininal Inhibotory Concentrations,MIC)。 2.PCR法扩增产ESBL大肠埃希菌菌株的ESBL基因型,比较不同ESBL基因型菌株对磷霉素的耐药情况。 3.PCR法扩增磷霉素耐药fos基因:选取30株磷霉素耐药菌株以及同期临床分离的30株磷霉素敏感菌株进行fosA、fosA3、fosB、fosB2、fosC、fosC2、fosX基因检测。 4.转运系统和靶酶相关基因检测:分别对6株磷霉素耐药fos基因阴性菌株、6株磷霉素敏感菌株、6株磷霉素耐药且fos基因阳性菌株进行murA、glpT、uhpT等基因检测,数据库比对其差异。 5.通过Southern杂交对磷霉素耐药菌株进行基因定位分析,以E.coli J53为受体菌,对磷霉素耐药菌株进行接合转移试验,分析耐药基因所在质粒的水平转移特性。 6.脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株间的同源性以及多位点序列分型(MLST)对菌株进行分型研究,同时与美国疾病控制和预防中心网站(http://www.cdc.gov/pulsenet/protocols.htm)进行比对分析。 结果: 1.636株分离自临床尿液标本的大肠埃希菌中,ESBL阳性356株,占56.0%,ESBL阴性280株,占44.0%。药敏结果显示,分离株对头孢替坦、碳青霉烯类、哌拉西林/他唑巴坦等少数抗菌药物高度敏感,敏感率在95%以上,对磷霉素的敏感性保持在95%左右;产ESBL大肠埃希菌对大多数抗菌药物的耐药率明显高于非产ESBL菌株,其中产ESBL菌株磷霉素的耐药率为6.7%,也明显高于ESBL阴性菌株的2.1%。 2.产ESBL大肠埃希菌的ESBL基因型主要为blaCTX-M型,其中blaCTX-M-1阳性率为54.2%,blaCTX-M-9阳性率为34.6%。blaCTX-M-1阳性组对磷霉素的敏感率为91.2%,blaCTX-M-9阳性组对磷霉素的敏感率为95.1%,不同blaCTX-M型别与磷霉素耐药率无统计学差异(p值为0.19)。 3.30株磷霉素耐药菌株中24株fosA3基因阳性,阳性检出率为80%,未检测到其它fos基因。 4.6株磷霉素耐药fos基因阴性菌株的murA、glpT、uhpT的测序结果与NCBI数据库中标准菌株E.coli K-12进行比对,其中DC1917、DC2091、DC25菌株中GlpT第297位上亮氨酸被苯丙氨酸替换,DC1917和DC2091菌株中第28位上异亮氨酸被天冬氨酰替代,另外DC25、DC93中30位也发生了替换;所有菌株UhpT均未出现氨基酸替换现象;DC1848、DC726既不携带磷霉素修饰基因,也未发生靶酶、磷霉素转运系统的突变。 5.30株磷霉素耐药菌株为供体菌,J53为受体菌,得到的接合子通过药敏、耐药基因PCR以及质粒提取等方法确认,最终获得14株磷霉素耐药接合子。 6.Southern杂交结果显示,fosA3基因位于~54.2Kb大小的可转移质粒上。部分菌株存在两个质粒携带fosA3基因的现象。 7.PFGE结果显示,fosA3阳性菌株之间同源性较低,MLST分型表明菌株ST分型较为分散,不存在克隆传播的现象。 结论: 1.尿液标本分离的大肠埃希菌对临床常用抗菌药物耐药现象比较严重,除对碳青霉烯类、哌拉西林/他巴唑坦等少数临床常用抗菌药物保持较高的敏感性外,对磷霉素也显示较好的敏感性,敏感率达90%以上。 2.不同ESBL基因型别与磷霉素耐药之间不存在相关性。 3.fosA3是本研究中大肠埃希菌对磷霉素耐药的主要机制。另外磷霉素靶酶(MurA)及转运系统蛋白的氨基酸替换也可能是本研究菌株中磷霉素耐药菌株的机制之一。其中2株既不携带磷霉素修饰基因,也未发生靶酶、磷霉素转运系统的突变。 4.尿液标本中分离的fosA3基因阳性的大肠埃希菌菌株不存在克隆传播的现象,PFGE同源性较低,ST散发存在。