论文部分内容阅读
TOLL样受体(Toll-like receptors,TLRs)是参与天然免疫的细胞跨膜受体及病原模式识别受体,它通过启动天然免疫反应和激发适应性免疫反应的信号传导,在宿主防御微生物病原体感染过程中发挥重要作用。维生素A作为一种免疫调节剂,对动物的抗感染能力和体内一些基因表达的影响十分明显。然而,目前尚无维生素A对不同品种猪TLRs基因表达影响的报道。本研究旨在比较考察不同品种仔猪TLRs表达规律的基础上,研究揭示VA对不同品种仔猪不同感染状态下组织TLRs表达量的影响。本研究共包括以下两个试验。试验采用2×4因子设计,即荣昌猪和DLY猪2个品种、4个日龄阶段(0、7、14和21d),比较考察地方仔猪和外种仔猪TLRs的基因发育表达规律。选取纯种荣昌仔猪和DLY仔猪各4窝,在仔猪出生后的0、7、14和21d,每窝各选1头正常仔公猪屠宰,分离肝脏、脾脏、肺、空肠和肠系膜淋巴结样品,液氮速冻。用Real-time PCR方法检测组织中TLR2,3,4,7,9基因mRNA的表达水平。结果表明,不同品种仔猪肝、脾、肺、肠系膜淋巴结和空肠组织中TLR2、3、4、7、9的mRNA表达量存在差异,荣昌猪显著高于DLY猪(P<0.05)；并且表达量随日龄增加呈现一定的变化规律,总体是随着日龄的增加,表达量显著增加P<0.05)。选择健康、21日龄断奶、体重3.5-4kg的荣昌仔猪和体重6.5-7kg的DLY仔猪各24头,在试验的前2周两个品种的仔猪均采食相同的VA缺乏日粮,仔猪单笼饲养；2周后,分别将两个品种的仔猪按体重随机分为2个处理,分别继续饲喂VA缺乏日粮和正常VA日粮(VA添加量2200IU/kg),即为2×2因子设计共4个处理,主效应分别为2个品种(荣昌和DLY)和2个VA添加水平(0和2200IU/kg),每个处理12个重复；继续饲喂2周后,再将每个处理一分为二,分别注射PBS液和蓝耳病弱毒疫苗(PRRSV),即为2×2×2因子设计共8个处理,主效应分别为2个品种(荣昌和DLY)、2个VA添加水平(0和2200IU/kg)、2种疫苗免疫状态(注射PBS液和注射蓝耳病弱毒疫苗),每个处理6个重复,每个重复1头仔猪；试验继续2周后,所有试猪麻醉后采样待测。同时,在试验的第2、4和6w末仔猪前腔静脉采血,分离血清待测。研究结果表明：1、不同VA营养状态模型建立。第2、4、6w末时血清视黄醇浓度DLY猪显著高于荣昌猪。随饲喂VA缺乏日粮时间的延长,两个品种仔猪血清视黄醇浓度均呈下降趋势,采食补充VA日粮后血清视黄醇含量增加。第4和6w末缺乏组血清VA含量较补充组分别降低9%和25.11%。同时,接种PRRSV加剧了血清视黄醇浓度的降低。2、PRRSV攻毒模型建立。血清中PRRSV抗体检测结果表明,所有试猪在第35d的血清中均未检测到PRRSV阳性,第42d的血清中,接种PRRSV的24头仔猪血清中均检测到PRRSV阳性。同时,第42d末接种PRRSV仔猪的肺和呼吸道组织中均检测到PRRSVmRNA,而未接种组均未检出。3、不同品种猪的ADG和ADFI差异显著,DLY猪的ADG(P<0.0001)和ADFI (P<0.0001)均显著高于荣昌猪。攻毒显著降低了ADG(P<0.0001)和ADFI(P=0.0036),显著升高了料重比(P<0.0001),且对DLY仔猪的影响程度显著强于荣昌仔猪(P<0.0001)。4、第4w末DLY仔猪血清IFN-γ浓度显著低于荣昌猪(P<0.05),IL-2和IL-4浓度品种间差异不显著。维生素A水平、品种与维生素A互作对血清IFN-γ、IL-2和IL-4浓度无显著影响。第6w末,DLY猪血清IFN-γ, IL-2, IL-4浓度略低于荣昌猪,差异不显著。除动物品种、维生素A水平和攻毒三者互作(P=0.0251)对血清IL-2的浓度产生显著影响外,品种、维生素A水平、攻毒以及三者间的两两互作均未对血清IL-2和IL-4浓度产生显著影响。除攻毒(P=0.0030)对血清IFN-y浓度产生显著影响外,动物品种、维生素A水平以及三者间的两两互作均未对血清IFN-γ浓度产生显著影响。5、猪品种、日粮VA水平、PRRSV的攻毒状态,以及它们间的互作影响TLRs mRNA的组织表达量。荣昌仔猪各组织TLR2、3、7、9的mRAN表达量均高于DLY仔猪,其中荣昌猪肝脏、肺、肠系膜淋巴结和空肠中TLR2、TLR3、TLR7(肺例外)和TLR9(肝和肠系膜淋巴结除外)的mRNA表达量均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于DLY仔猪。除脾脏外,VA缺乏均导致组织TLR2、3、7、9的mRAN表达量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)增加。PRRSV攻毒导致各组织中TLR2、3、7、9的mRAN表达量均有不同程度增加,对各组织中TLR7和TLR9的影响大于TLR2和TLR3。品种×VA、品种×攻毒、VA×攻毒、品种×VA×攻毒对组织TLR2、3、7、9的mRNA表达量存在不同程度的互作影响。综上所述,本研究结果表明,不同品种猪肝、脾、肺、肠系膜淋巴结和空肠等组织中TLR2、3、4、7、9的mRNA表达量存在差异,荣昌猪高于DLY猪,并且表达量随日龄增加总体呈显著增加。接种PRRSV后,不同品种间仍表现为荣昌猪组织TLR2、3、7、9基因表达量高于DLY猪。不同品种间的抵抗力可能与TLRs的表达有关。接种PRRSV上调了仔猪机体TLR2、3、7、9基因的表达。攻毒情况下,DLY猪比荣昌猪更敏感,易受病毒攻击的影响。日粮维生素A缺乏可以显著增加仔猪多种组织中TLR2、3、7、9的基因表达,而补充VA后可下调其表达。