脐带血(Umbilical cord blood, UCB),由于富含造血干／祖细胞(Hematopoietic stem/progenitor cells, HSPCs)、具有良好的移植优势,被视为治疗人类疾病的宝贵生物资源,目前已应用于治疗恶性血液病、实体瘤、遗传性疾病等。然而,单份脐带血中HSPCs含量过低,限制了其在临床上的应用。因此,在体外利用工程化的手段扩增脐带血中的HSPCs,成为了解决该问题的重要途径。目前,传统的体外扩增方法主要存在两方面问题：1)造血干细胞易过早分化,失去干性；2)扩增的目的细胞易引入异体细胞或异源因子,导致移植的失败。研究发现,体内的骨髓微环境,可以使HSPCs永久的维持自我更新。基于此,本文将首先构建仿生成骨细胞壁龛,为HSPCs提供间接的支持；其次,制备性能优异的胶珠作为HSPCs的包埋基质,隔离异体细胞或大分子；最后,在动态条件下,利用仿生壁龛扩增包埋的脐血CD34+细胞,以期实现CD34+细胞的高效扩增。仿生成骨细胞壁龛的构建：首先,通过冷冻干燥和化学交联法,制备了不同比例的载HAp-CS/Gel支架。其次,通过扫描电镜观察支架的形貌,发现HAp的掺入并不改变支架的形貌,支架孔径为135-150μm,具有良好的贯通性；通过测定孔隙率、吸水率、接触角等,确定了HAp掺入比例为100：20时,复合支架具有优异的性能：孔隙率大于90%,吸水率为19.1,接触角由88.5。变为45.8。,支架的表面亲水性增加。同时,通过能谱分析和红外光谱分析得出,支架中的组成成分间会发生交联反应,HAp以团聚体或颗粒的形式,均匀分布在支架的孔壁上,为成骨细胞提供足够多的生长位点。最后,将成骨细胞接种在性能最优的复合支架上,构建仿生壁龛,通过荧光染色和SEM观察,发现细胞可均匀分布于支架表面,并具有良好的活性；通过MTT测试和碱性磷酸酶检测得出,成骨细胞可以在复合支架中维持良好的功能。CAG细胞包埋基质的制备：首先,通过简单的液滴法制备了具有“核壳”结构的海藻酸钙／明胶(Calcium alginate/gelatin, CAG)胶珠,胶珠内部分布着网状的孔道,宽度约为18 μm。其次,通过机械强度测试和扩散实验得出,胶珠在两周的动态搅拌下可以维持一定的强度,且具有一定的半透性能,可阻止大分子蛋白的通过。最后,通过成骨细胞的包埋实验,验证了胶珠具有较优的生物相容性,适宜作为细胞包埋基质。包埋的脐血 CD34+细胞与仿生壁龛的动态共培养：首先,采用免疫磁珠法,从脐带血中逐步分离出CD34+细胞,通过计数、流式分析得到,CD34+细胞活率较高约为93.2%,CD34阳性表达比例为90.24%,可作为培养的起始细胞。其次,用CAG胶珠包埋CD34+细胞,在动态转瓶中与仿生成骨细胞壁龛进行共培养,同时,设置两个静态的对照组,来研究动态环境和仿生壁龛对CD34+细胞的作用。通过计算包埋收获的CD34+细胞的增殖倍数、活率得出,第10天时,动态共培养条件下,CD34+细胞扩增24.2±2.3倍,并且可以维持84.1%的活率,而两个静态组中,特别是无仿生壁龛支持的情况下,细胞扩增缓慢,且只有约50%的活率。通过流式测定CD34表达率、集落形成单元计数,发现在三组实验中,CD34的表达率都会下降,但动态实验组下降最慢,在10天时,CD34仍可维持80.3%的表达率；同时,动态实验组细胞的集落形成单元有明显的扩增,在第14天可以扩增11.7±2.5倍,而在静态组的扩增倍数则较低。以上结果,可以充分证明动态环境和仿生壁龛可以共同促进脐血CD34+细胞的增殖,并维持细胞的活性和干性。本文构建了一种新的扩增体系,即动态环境+仿生壁龛+包埋基质体系,来扩增脐血CD34+细胞。该体系不仅强化了营养物质或因子的传递,为CD34+细胞提供及时的营养,同时也通过仿生壁龛为CD34+细胞提供了类体内的微环境,使得CD34+细胞在实现扩增的同时,也可以维持一定的干性。基于基质的包埋隔离,扩增收获的CD34+细胞有望作为有效的移植体应用于临床。