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铅是一种在自然界中广泛存在的重金属。以往大量研究证实:铅在人体的蓄积可以引起铅中毒,引起包括中枢神经系统在内的全身性毒性。儿童是铅的易感人群,由于其代谢、发育等方面的特点,对铅的神经毒性特别敏感。铅中毒可造成儿童神经系统不可逆损伤,影响智力发育,损伤认知和学习记忆功能。所以,儿童铅中毒一直以来是全世界关注的重大公共卫生问题之一。大脑屏障由血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)、血脑脊液屏障(blood-CSF barrier,BCB)及脑脊液-脑屏障(CSF-brain barrier,CBB)三部分组成。对于限制血液和大脑组织之间大分子及有害物质的通过、维持大脑内环境的稳定具有重要的作用。铅对脑屏障中的毛细血管具有较高的亲和力,可以通过损伤大脑毛细血管内皮细胞的膜结构,破坏在内皮细胞间形成的紧密连接(tight junction,TJ),从而通过血脑屏障进入大脑实质中。本实验室以往研究发现:发育期铅暴露可以损害大鼠BBB的结构和功能,引起屏障通透性的增加和紧密连接蛋白的表达水平下降,但其调控分子机制尚不完全清楚。基质金属蛋白酶(MMPs)是细胞外基质蛋白酶体中重要的组成部分,其在细胞外基质的重塑和降解中发挥着重要的作用。研究显示MMP-2,MMP-9可以介导claudin-5和occludin这两种紧密连接蛋白的降解,从而导致血脑屏障的破坏。而MMP-2/9是否在铅暴露诱导的脑屏障损伤发挥作用,目前还没有相关研究。为进一步阐明铅损伤BBB、BCB通透性的机制,本实验通过建立体外BBB、BCB细胞模型,观察铅暴露对脑屏障的损伤作用,并研究星形胶质细胞释放的MMP-2/9在铅致脑屏障系统损伤和紧密连接蛋白表达降低中的作用,,为进一步阐明铅诱导脑屏障系统损伤的分子机制、探讨可能的防护措施提供研究基础。研究目的通过建立体外BBB和BCB模型,观察铅体外BBB和BCB模型的通透性、紧密连接蛋白的表达水平、以及胶质细胞释放的MMP-2/9水平的影响,明确MMP-2/9在铅诱导大脑屏障损伤中的作用和可能机制。研究方法1.采用C6细胞及人大脑微血管内皮细胞(HBMEC),建立合适的BBB体外共培养细胞系模型;采用Z310细胞系,建立BCB体外细胞模型。2.采用跨内皮电阻检测(TEER法)及葡聚糖法检测铅对BBB、BCB模型通透性的影响。3.Western blot及免疫荧光法法检测屏障中TJPrs表达及分布情况。4.q RT-PCR、Western blot法检测MMPs m RNA及蛋白表达。5.明胶酶谱法检测细胞培养液中MMPs酶活性。6.采用MMPs组织抑制剂抑制MMPs活性,观察其对铅所致屏障损伤的保护作用。研究结果1.MMP2/9在血脑屏障中的机制研究1)胶质细胞C6对BBB的影响a)HBMEC细胞加入未经Pb处理的C6条件培养液,共培养模型经过10μM铅处理后不会引起BBB屏障通透性出现大的变化(p>0.05);且24h的铅处理后,ZO-1及Occludin两种紧密连接蛋白的变化也不明显(p>0.05)。b)HBMEC细胞在加入Pb处理后C6条件培养液时,共培养模型经过10μM铅处理后BBB的通透性会显著增加(p<0.05);24h的铅处理后,ZO-1及Occludin的表达明显呈下降趋势(p<0.01),并呈现剂量依赖效应。2)BBB中铅暴露对MMP2/9的影响2.5、5、10μM的Pb分别处理12h、24h后,可以使C6胶质细胞中MMP2及MMP9的m RNA水平上表达上升(p<0.05),且具有剂量依赖效应;蛋白表达增高(p<0.05),使MMP2的酶活性显著提升(p<0.05),并具有一定的剂量依赖效应。3)MMP2抑制剂对铅所致BBB损伤的保护作用C6细胞加入APR100(MMP2组织特异性抑制剂)后,铅暴露24h后Zo-1及Occludin两种紧密连接蛋白的表达升高(p<0.05),屏障通透性得到了一定恢复(p<0.05)。2.MMP2/9在血脑脊液屏障中的机制研究1)铅暴露对BCB屏障功能的影响10μM Pb暴露造成BCB模型通透性的改变(p<0.05),并导致ZO-1及Occludin表达水平降低(p<0.01),表明Pb可以破坏BCB完整性。2)BCB中铅暴露对MMP2/9的影响BCB模型中,10μM以下的铅暴露对于MMP2/9 m RNA水平及蛋白表达水平上的改变均不显著(p>0.05)。研究结论1.铅暴露能够破坏体外BBB模型的通透性,使TJPrs中ZO-1和Occluudin表达下降。2.铅暴露后星型胶质细胞中MMP2及MMP9表达水平增加,且酶活性升高;抑制MMP2活性,能够使TJPrs的表达有所回升,屏障通透性也有一定程度的恢复。3.铅能够破坏体外BCB模型的通透性,抑制紧密连接蛋白的表达,但MMPs表达没有改变,这说明MMPs在铅破坏血脑脊液屏障中未起到重要作用。以上研究可以做为儿童铅中毒研究的理论基础,为儿童铅中毒的防治提供了一定的依据。