随着乳腺癌治疗水平的进步,在获得长期生存率的同时,患者对形体美的要求越来越高。乳腺癌术后乳房重建已被患者和医生广泛接受,成为常规治疗措施。追求更接近自体乳房组织的填充物及最大程度减少供区并发症,是临床医生追求的目标。其中组织工程的发展为解决这一难题提供了新的思路,其能以少量种子细胞,经体外扩增后与生物材料复合植入体内,最大程度减少供区并发症,有效解决了假体挛缩畸形、脂肪液化和吸收等问题,减少了二次手术率。我们推测脂肪组织工程将为乳房组织缺损的修复和重建带来新的希望。研究证实,脂肪干细胞(Adipose Derived Stem Cells,ADSCs)具有容易分离、增殖能力强、多向分化潜能和低免疫原性等特点,其取材容易、来源广泛,体内储备量大、能够在体外稳定增殖,少量脂肪组织即可获取大量干细胞并可成功诱导ADSCs为成熟脂肪组织从而对乳房组织进行修复或重建,有效解决了乳房重建中安全性等问题。干细胞-支架材料联合移植是减少细胞损伤,增加治疗效率的有效方式。但现有支架材料多存在制备复杂,血管再生缓慢等缺点,故寻找一种获取简便且临床可用性强的支架材料是该领域的研究热点。细胞外基质(Extra Cellular Matrix,ECM)对细胞增殖、分化及基因表达发挥重要的调控作用,且与天然组织三维结构相似,被广泛应用于组织工程研究。脱细胞脂肪组织基质(Decellularized Adipose Tissue,DAT)是脂肪组织来源的细胞外基质,其免疫原性低、组织来源广泛、具有促进脂肪组织新生和血管生成等作用,在体外能够为ADSCs提供良好的三维环境,我们认为将DAT与ADSCs联合移植将为乳房组织缺损的修复和重建提供新的思路。研究目的从人类吸脂脂肪组织中分别制备DAT及提取ADSCs,ADSCs作为种子细胞,DAT作为支架材料,体外行DAT-ADSCs共培养,研究DAT三维支架材料对ADSCs生物学特性的影响,探究DAT作为支架材料的可行性及优势;系统比较普通二维环境及DAT三维环境对ADSCs成脂分化的影响,观察DAT-ADSCs移植物的转归,为构建工程化脂肪组织进行初步探索。研究方法利用Zuk法分离培养人类脂肪来源干细胞,对P3代ADSCs行表型鉴定及成脂诱导培养,确定其成脂分化能力;对Flynn制备DAT方法进行改良,探索一种简单可行的制备DAT方法,制备DAT并确定其生物形状及生物安全性;定量比较普通二维培养与DAT三维培养下ADSCs生物学性能,测定DAT培养下ADSCs粘附率及增殖率,探究DAT三维培养下对ADSCs成脂诱导的影响并进行鉴定。研究结果1.吸脂脂肪组织可提取大量脂肪干细胞,原代培养的ADSCs在7-9天可生长至70%-80%融合,传代培养后脂肪干细胞贴壁生长、呈梭形、似成纤维细胞。取生长良好的第三代ADSCs经体外成脂诱导培养,诱导2周后,细胞逐渐变成椭圆形、圆形,由较小脂滴逐渐融合为较大脂滴。油红O染色后胞质内脂滴呈橘红色,结果可证实其为人类脂肪来源干细胞。2.吸脂脂肪组织经脱细胞处理后,每400ml吸脂脂肪组织可制备约15-30ml脱细胞脂肪组织基质,脱细胞脂肪组织细胞外基质为乳白色凝胶状结构,冷冻干燥制成粉末后呈白色粉末状。DAPI荧光染色显示DAT中无细胞成分残留,组织学染色结果显示DAT主要为胶原蛋白成分。电镜扫描观察显示DAT粉末颗粒表面积较大,孔隙率较高。3.脂肪干细胞在脱细胞脂肪组织基质中粘附率为86%。MTT法检测普通二维培养环境及DAT三维环境下ADSCs增殖率,结果显示ADSCs在DAT支架中可实现良好的粘附且无细胞毒性,ADSCs增殖能力不会受到影响,且有增强趋势。4.脂肪干细胞与脱细胞脂肪组织基质体外联合培养诱导14天后可成功诱导ADSCs为成熟脂肪细胞,随诱导天数增加,油红O染色可见细胞内脂滴较大且呈橘红色。研究结论:1.由吸脂脂肪组织分离提取的人类脂肪干细胞,其来源广泛、易于分离提取,经分离培养后可获得大量脂肪干细胞且具有向成熟脂肪组织分化的能力。2.脱细胞脂肪组织取材容易、制备过程较简单,且可根据不同需求加工成多种形状。对吸脂脂肪组织进行脱细胞处理后其细胞成分去除彻底,并且可保存较完整的细胞外基质成分,无细胞残留,具备良好的三维结构及生物学性能。3.人类脂肪干细胞与脱细胞脂肪组织基质联合培养,ADSCs可在其中实现良好的粘附及进行稳定增殖,可在适宜的诱导条件下向成熟脂肪组织进行分化。此外,DAT可提高ADSCs分化为成熟的脂肪细胞的能力,可作为理想的支架材料用于脂肪组织工程。