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枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）为蔷薇科（Rosaceae）枇杷属（Eribotrya）亚热带常绿果树,种类繁多,约有32个种（变种）,但是只有一个栽培种。其遗传基础狭窄,抗性差、种子多可食率低、光合效率低等性状长期无法改良。此外,枇杷树初冬开花,初夏成熟,花果极易受低温伤害,严重影响产量和品质。因此,培育抗寒、无核、高光效等综合性状优良的新品种,对产业发展具有重要意义。三倍体具有无核的特点,因此,选育抗寒三倍体枇杷新品种是重要的育种目标之一。课题组前期以贵州野生枇杷（2x,GZ23）和龙泉1号（4x,B431）为亲本,创制了一批三倍体F1代。对它们进行低温胁迫发现,三倍体F1代具有抗冻的特点;转录组分析发现,EjTIFY6B和EjMYC2基因与三倍体抗冻性状密切相关。已有研究证明,茉莉酸通路中,具有完整Jas结构域的TIFY蛋白与COI1基因特异性识别,导致TIFY蛋白泛素化降解,释放MYC类转录因子,以调控下游JA响应基因。且TIFY蛋白家族在植物应对生物胁迫和非生物胁迫起着重要作用,MYC类转录因子对植物的生长发育和抗逆也有直接调控作用。但EjTIFY6B和EjMYC2基因在枇杷中的功能及调控机制尚不清楚。为此,本研究克隆了EjTIFY6B、EjMYC2和EjCOI1基因,通过酵母双杂验证其转录激活活性和互作性。进一步分析EjTIFY6B和EjMYC2的表达模式,并且转拟南芥验证了基因功能,进而解析该基因在三倍体枇杷响应低温胁迫中的功能。主要研究结果如下:（1）冷胁迫下三倍体枇杷内源JA含量变化和氧化酶活性变化分析本研究对各倍性枇杷进行-5℃、-3℃、0℃、CK（25℃）处理,处理3d后,测其内源JA含量。结果表明,随着温度的降低,各倍性枇杷内源JA含量显著增加,且室温下,三倍体的内源JA含量显著高于二倍体和四倍体含量。将三倍体枇杷叶片进行-3℃低温处理并外施MeJA,测其2d内氧化酶活性的变化。结果表明,随着温度的降低,氧化酶活性显著增加。外施MeJA后,SOD、POD和CAT氧化酶活性显著升高,除SOD氧化酶以外,POD和CAT氧化酶活性随着低温处理时间越长,活性逐渐增高,24h达到顶峰,而SOD氧化酶活性在6h达到顶峰,然后活性逐渐降低。（2）基因的克隆、表达及生物信息学分析通过同源克隆的方法,从三倍体枇杷中成功克隆出EjTIFY6B、EjMYC2和EjCOI1基因,其CDS长度分别为1188bp、2058bp、1764bp,分别编码395个、685个、587个氨基酸和一个终止密码子。将EjTIFY6B和EjMYC2编码的氨基酸作序列对比,发现EjTIFY6B基因的中间序列和C端分别具有保守并且完整的TIFY/ZIM和Jas结构域,EjMYC2基因序列具有保守的JID结构域、TAD结构域和b HLH结构域。进化树分析显示EjTIFY6B和EjMYC2基因与苹果和梨中的TIFY6B和MYC2基因亲缘关系最近。枇杷、苹果和梨皆属于蔷薇科果树,这和传统分类学相一致。实时荧光定量分析表明,与CK相比,-3℃低温处理的EjTIFY6B基因表达量具有显著降低的趋势,而EjMYC2基因表达量则有显著上升的趋势。在外施MeJA后,EjTIFY6B基因表达量在12h达到峰值然后下降,其可能的下游低温响应基因ICE、CBF1、CBF2具有相应的变化趋势。故笔者初步推测,在枇杷响应低温的茉莉酸信号通路中,EjTIFY6B可能作为转录因子的抑制子响应茉莉酸信号,EjMYC2作为转录因子通过ICE–CBF途径诱导下游的COR抗寒基因的表达。进一步我们构建了植物荧光表达载35S::EjTIFY6B-GFP,亚细胞定位显示于细胞核,表明其在细胞核中行使功能,具有完整的jas结构域核定位的特性。（3）酵母双杂分析为了验证EjTIFY6B、EjMYC2和EjCOI1基因间的相互作用,构建了p GBKT7-EjTIFY6B、p GBKT7-EjMYC2、p GADT7-EjMYC2、p GADT7-EjCOI1酵母双杂载体。自激活实验表明,EjTIFY6B不具有转录自激活活性,而EjMYC2具有转录自激活活性。共转化实验显示,EjTIFY6B分别与EjMYC2和EjCOI1具有相互作用。（4）转化拟南芥功能分析构建了EjTIFY6B、EjMYC2基因的超表达载体,通过花序侵染法成功获得了EjTIFY6B、EjMYC2转基因植株。经过拟南芥的叶形态比较,发现转基因拟南芥较野生型拟南芥叶片增大。根敏感性实验表明,在含有MeJA的MS培养基中,与野生型拟南芥相比,EjTIFY6B转基因拟南芥的根显著增长,对MeJA不敏感;而EjMYC2转基因拟南芥的根显著缩短,对MeJA表现出强敏感性。在低温处理下,EjTIFY6B、EjMYC2转基因植株的表达模式为:EjTIFY6B在1h内被快速诱导,然后表达量逐渐降低,而EjMYC2随低温处理时间越长表达量越高。低温处理后,EjMYC2转基因拟南芥无明显萎蔫,相对电导率比野生型低;恢复正常温度后,存活率高于野生型,生长势也明显强于野生型。而EjTIFY6B转基因拟南芥叶片出现大量萎蔫,相对电导率显著高于野生型;恢复正常温度后,存活率低于野生型,生长势也明显弱于野生型。综上所述,EjTIFY6B与EjMYC2共同响应枇杷低温胁迫反应,前者负调控,EjMYC2则为正调控。而它们在不同倍性枇杷中的表达变化规律,尤其是三倍体枇杷抗冻相关的表达模式及分子调控机制尚待进一步深入研究。