CaMBP-10及其突变体4ABP-10转基因拟南芥抗生物和非生物胁迫机制的研究

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植物转脂蛋白(lipid transfer proteins LTPs)是一类广泛存在于高等植物中的、由多基因编码的碱性小分子蛋白家族。近年来发现LTPs在植物防御反应中有重要作用,它能不同程度的特异性抑制各种病原真菌的生长和促进植物系统抗性的产生。Ca2+是植物中最重要的信号分子,几乎参与了所有植物细胞生理功能的调节,在植物防御反应中钙信号系统也发挥着重要作用。近年来,相继报道了钙调素(calmodulin,CaM)及其结合蛋白(CaMBP)参与植物系统抗性功能的调节。我们实验室经过多年研究,从中国大白菜中分离和鉴定了钙调素结合蛋白BP-10(CaMBP-10)。较早的研究发现CaMBP-10通过与CaM的特异结合对植物生长素诱导的细胞伸长和酸分泌,质膜H-ATPase活性及磷酸化作用,NAD激酶的激活作用,类囊体蛋白的磷酸化等均有显著影响。近年来,我们克隆了BP-10的cDNA全长,并进行表达与鉴定。通过核苷酸序列比对、蛋白质结构和脂结合活性分析,证明其具有典型的LTPs CD二级结构特征图谱及体外脂结合活性和抗真菌活性,确认其是植物转脂蛋白家族的新成员。   为了进一步证明LTPs在增强植物系统抗性方面的作用以及植物转脂蛋白是一类新的CaMBP,揭示CaM参与LTPs功能调节的普遍性,我们构建并克隆了BP-10和BP-10的CaM结合缺失突变体4ABP-10,表达纯化后获得了纯的BP-10和4ABP-10蛋白。CaM凝胶覆盖法分析重组。BP-10和4ABP-10结合钙调素能力的实验证明了重组4ABP-10失去了和CaM结合的能力。脂结合活性的实验结果显示重组BP-10和4ABP-10与野生型 BP-10的脂质结合活性完全相同,说明我们构建的重组4ABP-10只是失去了和CaM结合的能力,仍具有转脂蛋白的功能,对研究体内BP-10与钙调素结合具有实际的生物学意义。通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,分别获得了BP-10超表达和BP-10的CaM结合缺失突变体4ABP-10转基因拟南芥T0代,通过Kana抗性筛选、PCR、单碱基突变突变体鉴定和RT-PCR等方法进行鉴定和筛选,获得了转基因拟南芥纯合体。通过地高辛标记的southern杂交对转基因拟南芥进行进一步鉴定,并检测出了不同转基因拟南芥株系中外源序列的拷贝数。我们对转基因拟南芥的种子,幼苗和成苗进行了盐、旱的非生物胁迫,统计它们的发芽率、根长和存活率。对成苗进行真菌孢子侵染的生物胁迫。并对真菌胁迫的植株叶片进行台盼蓝染色,通过显微镜照相观察孢子和菌丝的生长情况。结果显示BP-10超表达转基因拟南芥植株在整个胁迫过程中的生长状态都要明显好于突变体4ABP-10转基因拟南芥植株和野生型植株,而突变体4ABP-10转基因拟南芥植株与野生型植株的生长状态没有明显区别,说明BP-10在植物系统抗性过程中有着重要作用,并且证实了BP-10是通过与CaM结合发挥作用的,是一类新的CaM结合蛋白。
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