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microRNA(miRNA)在细胞内普遍表达,这种非编码RNA能够实现基因的转录后调控,广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡、组织器官发育以及疾病发生等生命过程。miRNA的保守性、特异性表达及转录后沉默机制,使其在疾病的诊断、治疗和新药研发中发挥着越来越重要的作用。禽流感病毒由于其高致命性和传染性,每次爆发均造成巨大的破坏,现阶段流感的防治主要集中在注射疫苗免疫和服用常规药物,但流感防治的最大问题在于疫苗和药物的研发落后于病毒的突变速度。鉴于miRNA在肝炎和HIV中的治疗应用,借助SOLID平台,我们研究了禽流感病毒感染后细胞内的miRNA表达谱,筛选出表达显著差异的miRNA,设计新的数学模型衡量miRNA对靶基因的综合效应,系统分析受到显著影响的生命进程及细胞内通路,探索外源miRNA与病毒复制的相关关系。
具体来说,本论文开展以下工作并获得如下结果:
一、实现流感病毒对宿主细胞的感染,在感染后的不同时间点观察细胞病变,提取宿主细胞内RNA,完成miRNA的SOLID测序,对SOLID原始数据加工处理,提出miRNA丰度概念,衡量每一miRNA在样本中的比重,观察不同感染时间下miRNA丰度的变化。miRNA丰度分析表明:大部分miRNA处于低丰度水平,并且高丰度的miRNA在不同时间点表达趋于稳定,而低风度的miRNA则有较大的变化。
二、借助计算公式及统计学分析方法,进一步分析miRNA的表达倍数变化,重点考察表达差异显著的miRNAs。利用miRNA靶基因预测平台PicTar数据库及其打分机制,设计新的数学模型,对数据库中的每一靶基因进行加权计算,获得加权得分。使用定量PCR对测序进行验证,表达显著差异的主要有:miR-103、miR-17、miR-21、miR-15a、miR-185、miR-210、miR-30b及let-7i等。这些表达差异显著的miRNA既可以为禽流感病毒的理论研究研究提供依据,也能为禽流感的治疗提供潜在药物。
三、统计学验证靶基因的得分,采用Z-Test筛选具有统计意义的靶基因并加载入DAVID数据库,进行GO及KEGG分析,研究受到microRNA显著影响的细胞内生物进程和信号通路,系统分析流感病毒与细胞间的相互作用。KEGG分析表明在病毒感染不同时间后,细胞内的多种通路受到显著影响,涉及到信号转导、细胞连接、物质转运及代谢等。GO分析表明胞内生物进程同样受到显著影响,包括刺激响应、基因沉默、转运、细胞周期调控和细胞通讯等。
四、借助SOLID测序数据及定量PCR筛选miRNA,以化学合成的成熟体形式转染入细胞内探索外源miRNA与病毒复制的相关关系。筛选出六种miRNA并用于细胞转染,观察外源miRNA对病毒复制的影响,结果表明miR-21和miR-15a转染后对病毒的复制起负作用,而mirR-185、miR-2lO、miR-30b及let-7i对病毒的复制起正作用。