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背景:肝纤维化是各种慢性肝病进展至肝硬化的必经阶段,也是肝硬化逆转治疗的关键阶段,主要与HSC激活及活化HSC的转归密切相关,目前尚无有效防治药物。尽管肝纤维化时肝内活化HSC的来源尚有争议,但HSC无疑仍是抗肝纤维化治疗的重要靶点。HSC激活是一个渐进的过程,因此,抑制HSC激活或逆转HSC活化状态的策略都具有治疗肝纤维化的潜能。我们的合作者—中国科学院上海高等研究院黄福德教授课题组发现PAO能显著抑制体外培养间充质干细胞α-SMA和Calponin1表达,抑制间充质干细胞向肌成纤维细胞方向分化(尚未发表的资料),提示PAO可能具有抗肝纤维化潜力。目的:(1)探讨PAO对HSC-T6(大鼠肝星状细胞系)活化状态的影响;(2)探讨PAO对大鼠原代HSC体外激活的影响及机制。综合评估PAO的抗肝纤维化作用及机制。方法:(1)以不同浓度(25、50、100、150及200nmol/L)PAO处理HSC-T6细胞24h,观察PAO对HSC-T6活力的影响;应用MTT法检测PAO对HSC-T6细胞增殖的影响,以评估PAO的细胞毒性;抽提PAO处理细胞及对照组细胞RNA及总蛋白质;应用Real-Time PCR及Western-blot检测各组细胞α-SMA、COLI、COLIII mRNA及α-SMA蛋白表达。(2)SD大鼠原代HSC的分离及培养;应用Western-blot检测培养第1d,3d,4d,7d原代HSCα-SMA蛋白表达并观察细胞形态学变化,评估原代HSC体外激活过程的动态变化规律;以不同浓度PAO处理分离培养第4d的原代HSC,应用Real-Time PCR及Western-blot检测PAO处理后HSCα-SMA、COLI、COLIII mRNA及α-SMA和磷酸化Akt蛋白的表达。结果:(1)MTT结果显示,随PAO浓度增高,HSC的存活率明显下降,当PAO浓度增高至150nmol/L时,HSC细胞存活率下降为为对照组的82%(P<0.05),当PAO浓度增加至200nmol/L时,细胞存活率降低为对照组72%以下(P<0.01),结果表明25-100nmol/L浓度的PAO对HSC毒性小,细胞存活率均在90%以上,确定为有效工作浓度;Western-blot结果显示,与对照组相比,PAO能降低HSC-T6细胞α-SMA的表达,差异具有统计学意义;荧光实时定量PCR结果显示,与对照组相比,PAO可以降低α-SMA及COLImRNA的表达,差异具有统计学意义,但是对COLIII的表达没有影响。(2)密度梯度离心法提取SD大鼠原代HSC,发现随着培养时间的延长,HSC的活化程度逐渐增强,养1d时多数细胞已贴壁,呈扁圆形或椭圆形,离体培养4d时原代HSC呈初始活化状态,培养7d时呈完全活化状态;Western blot结果显示,随着培养时间延长,HSC的α-SMA表达量逐渐升高,离体培养4d时表达量为(1.51±0.045)较对照(0.762±0.062)明显增高(P<0.05),离体培养7d时α-SMA表达量进一步升高(1.752±0.053)。PAO可以剂量依赖性下调离体培养4d的HSCα-SMA蛋白表达,在50、100nmol/L浓度时,α-SMA表达量分别为(0.63±0.078)、(0.41±0.09)显著低于对照组(1.53±0.039),P<0.05);Real-time PCR结果显示:与对照相比,各浓度PAO对HSC表达α-SMA、CollegneI mRNA表达均有显著抑制作用,且呈浓度依赖性增强(P<0.01);Western blot结果显示,与对照组相比,PAO可明显下调离体培养4d的HSC PI4K及p-Akt蛋白表达。结论:PAO在25-100nmol/L浓度范围内对HSC-T6无明显细胞毒性,但可明显逆转HSC的活化程度及抑制原代HSC的自发激活,其机制可能与阻断PI3K-Akt信号通路有关,提示PAO可能具有抗肝纤维化潜力。