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第一部分人喉癌细胞系Hep-2和AMC-HN-8中侧群细胞的检测和分选目的探讨人喉癌细胞系中是否存在肿瘤侧群细胞及建立可靠的喉癌细胞系侧群细胞(SP细胞)检测及分选的操作规程。方法以人喉癌细胞系Hep-2和AMC-HN-8为研究对象,5μg/mL Hoechst 33342, 150μmol/L维拉帕米,1μg/mL碘化丙啶,应用流式细胞技术检测细胞系中SP细胞的比例并对Hep-2中SP细胞进行分选并检测其纯度。以含血清培养基培养SP及non-SP细胞及细胞爬片,观察细胞活性及培养后细胞形态。结果Hep-2细胞SP比例为17.1±2.0%,AMC-HN-8中SP的比例为11.8±1.7%。经维拉帕米处理后比例分别降为0%及0.3±0.1%。流式细胞术分选Hep-2细胞SP的纯度可达99.2±0.2%,non-SP细胞的纯度达98.5±0.5%；在含血清培养基中SP及non-SP细胞均贴壁生长,死细胞少,爬片检查提示均为典型的鳞癌细胞表现。结论喉癌细胞系中存在SP细胞,能被维拉帕米所抑制,流式细胞技术可有效的分选SP细胞。第二部分人喉癌Hep-2细胞系中肿瘤侧群细胞生物学特性目的通过与non-SP相比较,研究喉癌Hep-2细胞系肿瘤SP细胞的生物学特性。方法分选的1×104SP细胞及non-SP细胞以0.2ml无血清培养基种植于同一96孔板上,在1、3、5、7d观察生长状态并用CCK-8法测定细胞的增殖状态,绘制细胞生长曲线,比较两组细胞的增殖速度；分选后细胞在含血清培养基中培养的0、4、8、12d用流式细胞仪动态测试SP细胞在培养体系中的百分比,以评估其分化能力；分选的1×104SP细胞及non-SP细胞种植于同一96孔板上,培养1天后以2Gy的剂量射线照射,2d后用CCK-8法测定细胞的增殖状态,计算射线对细胞的抑制率,比较两组细胞对放射线的耐受性；将1×105,5×104及2×104的SP及non-SP细胞分别注射于8只NOD/SCID鼠的腋窝皮下,8周后观察成瘤情况,比较两组细胞的致瘤性。结果在无血清环境下SP细胞及non-SP呈不贴壁、球形、半透明状,培养后SP细胞渐成簇生长,而non-SP细胞不能形成细胞球；在第1、3、5、7d时SP细胞的吸光度分别为0.665±0.017,1.086±0.069,1.387±1.107,1.675±0.07,而non-SP细胞为0.694±0.053 0.951±0.031 1.049±0.092,1.008±0.086,除第1d外均具有显著性差异；分选后SP细胞在含血清培养基中培养的4、8、12d时SP的比例为47.8±1.1%,27.8±3.6%和17.3±1.9%,而non-SP培养后为2.2±0.1%,4.7±0.4%和4.9±0.3%；经射线照射后SP细胞与non-SP细胞的抑制率分别为6.7±3.5%和29.9±4.9%(t=14.295,p=.000)；细胞数为5×104,SP与non-SP的成瘤数分别为7和2(p=0.41),细胞数为2×104时成瘤数SP细胞成瘤数为6,而non-SP不能成瘤(p=0.007)。结论Hep-2细胞系中的SP细胞具有很强的增殖、分化、成瘤能力,对射线具有耐受性,证明该SP细胞具有干细胞的相关特性,它富含肿瘤起始细胞。但同时也说明SP细胞也是不均质的,我们不能将SP细胞认为是肿瘤干细胞。第三部分人喉癌Hep-2细胞系肿瘤侧群细胞中干细胞相关基因的表达分析目的探讨干细胞相关基因CD133、ABCG2、Bmi1、Notch2及PTEN在SP细胞中的表达。方法以Realtime PCR检测SP细胞与non-SP细胞CD133、ABCG2、Bmi1、Notch2及PTEN在SP细胞中的表达的差异。结果CD133、ABCG2、Bmi1及NOTCH 2在SP细胞中高表达,而PTEN在SP细胞与non-SP细胞中表达无明显差异结论干细胞相关基因在SP细胞的形成及维持中可能起重要作用,ABCG2在SP细胞的形成中起重要作用,这些基因可能成为喉癌治疗的潜在靶点。