目的:幽门螺杆菌(Helicobacte pylori,Hp)是一种常见的胃肠道致病菌,与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌的发病密切相关。随着抗生素耐药率逐渐增加,传统Hp根除治疗方案的效果逐渐下降。益生菌的抗Hp作用得到大量科学研究的证实,但目前益生菌主要来源为肠道、乳制品,且其抗Hp效果并不理想。本研究通过选择性乳酸杆菌分离培养技术及琼脂糖微包埋技术对人体胃黏膜细菌进行分离培养、鉴定,寻找潜在抗Hp益生菌,探讨其益生菌特性及抗Hp作用的潜在机制。方法:采用乳酸杆菌选择性分离培养技术在厌氧条件下对人体胃黏膜细菌进行分离培养、通过菌落形态、革兰氏染色结果、16S rRNA序列分析及进化树构建鉴定菌株。采用酸生存实验,在体外pH2条件下分别培养30min,60min,120min,评估加氏乳杆菌在低pH条件下的生存能力。采用全基因组测序技术,对加氏乳杆菌的基因组一般特性及抗菌肽基因与Hp相关性进行分析。采用琼脂糖微包埋技术在有氧条件下,通过过滤、荧光计数等方法按1:10比例包埋单个细菌,在脑心浸液培养基(Brian Heart Infusion,BHI)培养48h。提取细菌基因组DNA,通过16SrRNA序列分析、BLAST比对及构建进化树鉴定菌株。结果:404例胃黏膜活检标本分离鉴定出108株乳酸杆菌,其中加氏乳杆菌11株。其检出率为2.7%(11/404),占所有乳酸杆菌的10.2%(11/108)。与加氏乳杆菌阴性组相比,定植加氏乳杆菌的患者Hp检出率显著下降(38.7%vs 9.1%,P<0.05)。研究结果提示,胃内自然定植的加氏乳杆菌具有潜在的抑制Hp生长的作用。通过体外耐酸特性研究证实人胃黏膜加氏乳杆菌分离株具有强耐酸特性,其中LG4,LG2以及LG11酸耐受能力最强,pH2下暴露30min,细菌生存率可到90%以上,可以作为抗Hp益生菌的候选者。进行基因组测序的6株加氏乳杆菌中,4株细菌可表达抗菌肽,且对应的4例胃黏膜标本均未感染Hp,这一研究结果提示加氏乳杆菌的Hp生长抑制作用可能通过抗菌肽发挥作用。采用微包埋技术从胃黏膜标本中分离出37个菌株,分属12个菌种。其中,Brevibacillus agri、Bacillus flexus、Micrococcus antarcticus及Microbacterium oleivorans四种细菌首次从胃黏膜标本中分离到。针对微包埋方法培养出的12种细菌,从PubMed中搜索相关文献,发现Staphylococcus hominis可产生抗菌肽,且具备耐酸、耐胆汁、抗氧化及粘附上皮细胞的特性,提示其可能具有潜在抗Hp作用。结论:1.人体胃黏膜加氏乳杆菌分离株具有潜在抗Hp作用;根据耐酸特性、基因组一般特征及抗菌肽基因序列分析,LG2具有较强耐酸特性并可产生抗菌肽,可作为未来抗Hp益生菌的良好候选者。2.本研究首次从胃黏膜标本中分离出Brevibacillus agri、Bacillus flexus、Micrococcus antarcticus及Microbacterium oleivorans四种细菌。结果证实微包埋技术能够用于胃黏膜菌群培养,为进一步优化标准培养条件、分离出更多菌种提供理论和实验基础。3.研究表明Staphylococcus hominis具备耐酸、耐胆汁、抗氧化及粘附上皮细胞的特性,另一反面,该细菌可产生抗菌肽,抑制其他细菌的生长。因此,Staphylococcushominis具备成为抗Hp益生菌的潜在特性,有待进一步深入研究。