背景与目的：原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)恶性程度高,被誉为“癌中之王”,在全球常见癌症中居第五位,且发病率呈逐年上升趋势。其预后极差,在未做积极治疗的患者中,中位生存期仅有8个月。但患者如能在HCC的早期阶段得到积极治疗,预后可以得到明显的改善。因此,从临床方面看,早期诊断将明显提高肝细胞癌的手术治疗作用,也是提高其预后的关键之一。临床上,MRI扫描是诊断HCC的常用方法,但是HCC在磁共振诊断技术中具有较明显的不典型性,特别是由肝硬化发展而来的HCC,更容易受多种局灶性结节病变的影响,这降低了HCC的确诊率。而常用对比剂由于缺乏对HCC进行特异性地诊断,很难在早期鉴别肿瘤。近年来,分子影像技术,特别是磁共振方面的分子影像,通过高亲和性的分子探针,利用高特异性的靶向结合作用,能够敏感快速地探测到靶向病灶,并可以从分子层面分析病灶。因此分子影像可望成为实现肝细胞癌早期诊断有力工具。在肝细胞癌磁共振分子影像中,分子靶点以及配体的选择关系到诊断的敏感性及特异性。研究发现在HCC中,磷酯酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)蛋白在肝癌细胞表面过度表达并具有很高的特异性,动物实验表明以GPC3作为靶点的单克隆抗体介导的MR免疫成像能够检测出微小的HCC癌灶。在配体选择方面,抗体是使用最广泛的,但以单克隆抗体作为配体,存在的局限性不仅是价格昂贵、具有致免疫性,并且更为重要的是,抗体的高分子量会导致较差的组织穿透力,进行体内研究时会明显减弱其靶向作用。所以与抗GPC3单克隆抗体相比,L5多肽具有相同的靶向性能但其分子量小、价格低廉且无免疫源性。在成像方式方面,为了提高对比增强作用,引入生物素-亲和素系统(biotin-avidin system, BAS)。此系统具有高亲和性及高特异性,并易于结合多种标记物而不影响其功能。对比起直接靶向法,BAS能明显地提高靶向组织的对比剂摄取量。因此,本文应用L5多肽作为靶向GPC3蛋白的配体,将与聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)结合的超小超顺磁性氧化铁(ultra-small superparamagnetic iron oxide, USPIO)作为对比剂,并应用生物素-亲和素预定位系统,进行HCC磁共振分子成像。研究内容及方法：1.采用直接免疫荧光检测L5多肽与肝癌细胞的结合情况：通过收集对数生长期HepG2肝癌细胞和人正常肝细胞HL-7702并计数,以每孔5×105分别接种在六孔板,各设3个复孔,37℃培养过夜；用无血清培养基配制0.1 mg/mlL5-FAM溶液,然后去除六孔板内培养液,PBS液洗涤,加入2 ml L5-FAM溶液至每个孔中,37℃恒温培养箱避光孵育2h；用PBS液洗涤,去除未结合荧光多肽,加入4%多聚甲醛室温固定细胞,用PBS洗涤,然后滴加荧光抗淬灭剂,然后置于倒置荧光显微镜观察,并用FAM溶液作对照进行实验。2.L5多肽与肝细胞癌的结合抑制实验检测结合的特异性：选择HepG2作为研究对象,先将浓度为1 mg/ml的未标记FAM的L5多肽加入培养板六孔板中的各孔,孵育1h,随后加入0.1 mg/ml的FAM-L5避光孵育2h；清洗、固定后,观察荧光表达。3.免疫荧光法检测HepG2肝癌细胞GPC3表达验证：选择HepG2作为研究对象,计数、铺板后,4%多聚甲醛固定,用稀释后的抗GPC3一抗(5%BSA以1：100稀释)于4℃中孵育过夜；洗涤后,用FITC标记的二抗标记上述一抗；洗涤后,观察荧光表达。4.通过酰胺反应合成链霉亲和素化PEG-USPIO:取5 ml 0.1 mol/L MES缓冲液(pH 6.0)溶解的PEG-USPIO (1 mg Fe/ml),加入2.0 mg EDC和5.5 mgsulfo-NHS,室温下摇床振荡15 mmin以充分反应；②加入7.0μl2-巯基乙醇来阻断EDC反应；③超滤离心管离心除去还原剂和阻断剂,漂洗3次,重悬在PBS缓冲液(pH 7.4)中；④加入3 mg SA,室温摇床振荡2 h；⑤加入终浓度为30 mM的乙醇胺终止反应；⑥超滤离心管离心除去多余的SA和阻断剂,漂洗,纯化好的合成物重悬在PBS (pH7.4)中,调节浓度为1 mg Fe/ml。并将所制备制剂用DMEM培养基及1640培养基稀释溶解,存放在4㈧环境中,以测试其稳定性。5.通过激光粒度分析仪测定PEG-USPIO和SA-PEG-USPIO的粒径及电位：吸取15μ]制备的相应样品,用去离子水稀释至离心管,终浓度为0.6 mmol/L,采用Malven-3000HS激光粒度分析仪测定Zeta电位和粒径及其分布,所选激光光源波长为633.0 nm,测试温度为25.00±0.05℃,光信号用256通道、高速数字相关器进行处理。6.测定PEG-USPIO和SA-PEG-USPIO的T2弛豫率：取20支5 ml试管,分两组,各10支,第一组每管分别装Fe浓度为0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.2、0.4、0.6 mM的PEG-USPIO 5 ml,第二组为SA-PEG-USPIO,浓度梯度同前。采用T2 mapping(运用反转恢复快速自旋回波技术)序列对各管进行横断成像,4个回波,TE分别为20、40、60、80 ms, TR为2000 ms, NEX为4,FOV为75×75 cm,层厚2 mln,层间隔2 mm. T2 mapping原始数据使用Functool软件包的T2 mapping分析软件,计算每个试管ROI的T2值,选取三个层面,取其平均值,以铁浓度为横坐标,1/T2为纵坐标作直线回归方程,所得斜率为T2弛豫率。7.采用MTT法体外评价SA-PEG-USPIO和PEG-USPIO的细胞毒性：HL-7702正常肝细胞接种于96孔板中,37℃,5%CO2条件下过夜,分别加入含有PEG-USPIO和L5-PEG-USPIO的培养基(每孔的铁浓度为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 mmol/L),每组设3个复孔,其中以仅含培养基的孔作为调零孔,以仅含正常细胞及培养基的孔作为对照孔；37℃,5%C02条件下培养24 h后,每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20μL,继续培养4 h,弃去上清液,每孔加150μLDMSO,置于平板振荡仪上振荡10 min；置于酶标仪上,在490 nm波长处测定OD值(吸光度值)；计算细胞存活率并分析样品细胞毒性。并利用析因设计法及单因素方差分析,考察两个处理因素对细胞毒性的影响差异。8.普鲁士蓝染色验证L5-BT介导下SA-PEG-USPIO与HepG2的结合能力：HepG2和HL-7702各接种在12孔板,并选择对数生长期的细胞进行实验,各分为3组：L5-BT/SA-PEG-USPIO组：先加入0.2 mg/ml的L5-BT,孵育2 h,洗涤3遍后,加入Fe浓度为1.8 mmol/L的SA-PEG-USPIO,孵育2 h;SA-PEG-USPIO组：直接加入Fe浓度为1.8 mM的SA-PEG-USPIO,孵育2 h；未加药物组。每组设6个复孔;普鲁士染色：清洗,固定,用普鲁士蓝反应液染色,后用0.5%核固红复染,清洗后置于倒置显微镜下观察并拍照。9.体外MR成像观察：相应试剂孵育后的细胞消化、离心后重悬于2 ml 1%琼脂糖离心管中,行MR扫描。采用T2 mapping序列成像,以获得T2值伪彩图；T2WI FSE序列(快速自旋回波序列),TR=2500 ms, TE=96 ms, NEX为4,FOV为75÷75 cm,层厚2 mm,层间隔2 mm,图像采集后计算每个试管ROI的T2信号强度,选取三个层面,取其平均值,并以相同浓度空白琼脂糖的信号强度为标准,对每个试管进行标准化处理。10.体内MR成像观察：肝细胞癌移植瘤模型在预定位组中经尾静脉注射生物素化多肽L5,腹腔注射链霉亲和素再经尾静脉注射SA-PEG-USPIO探针,采用3.0T磁共振扫描仪进行T2WI SE序列成像,并以尾静脉注射PEG-USPIO作为对照组：扫描后取肿瘤组织进行普鲁士蓝染色及免疫组化分析,以探讨L5介导预定位法磁共振成像对HCC的靶向增强作用。结果：1.免疫荧光实验显示多肽L5出现在HepG2细胞表面以及胞质内,而HL-7702细胞只有少许荧光显示,且FAM的孵育也只是出现微量的荧光。抑制实验中可以看到HepG2细胞内的荧光信号明显减弱甚至消失；并且绝大部分HepG2表面以及胞质内均有较为明显的荧光表达。HepG2肝癌细胞GPC3受体阳性表达染色。2. SA-PEG-USPIO和PEG-USPIO溶液均呈黑色,前者水合直径为(35.97±5.19)nm,分散系数(PdI)为(0.17±0.05),Zeta电位为(-7.91±1.22)mV,后者直径为(22.73+3.31)nm,分散系数为(0.21±0.02),Zeta电位为(4.22±0.53)mV。两者分散系数均较低(0.2左右),说明两者在水溶性条件下粒径较为均匀,未出现明显聚集。两种试剂在PBS及两种培养基溶液中稀释存放6个月,均未见明显沉淀。随着SA-PEG-USPIO和PEG-USPIO铁浓度的增加,T2值逐渐下降,1/T2值相应上升；两者的T2弛豫率分别为0,1039×103和0.1394×103 mM-1s-1。3.MTT法测定结果显示随着Fe浓度的增加,两实验组的HL-7702细胞的存活率有所下降,但存活率均可达到80%以上,并且从所得数据作出回归曲线可得出SA-PEG-USPIO和PEG-USPIO的半数抑制量分别为9.36和8.97 mM,这提示SA-PEG-USPIO和PEG-USPIO在体外实验所需的Fe浓度区间内为低毒性,能用于后续实验。4.体外实验的普鲁士蓝染色结果显示,L5-BT/SA-PEG-USPIO组中HepG2细胞的胞膜胞质内可见大量蓝染铁颗粒,部分呈聚集状态。而在HepG2细胞的SA-PEG-USPIO组以及HL-7702细胞各组中,只出现少许的蓝染铁颗粒。5.体外MR成像显示,L5-BT/SA-PEG-USPIO组中HepG2细胞的T2信号明显低于其他各组。通过标准化T2WI信号强度的数据,采用多组独立样本单因素方差分析以及SNK两两比较的统计学方法可以得出L5-BT/SA-PEG-USPIO组、SA-PEG-USPIO组中HL-7702细胞的标准化T2WI信号强度以及SA-PEG-USPIO组中HepG2细胞的标准化T2WI信号强度分别为69.00±11.07、78.22±8.41和76.91±12.30,而L5-BT/SA-PEG-USPIO组中HepG2细胞的标准化T2WI信号强度是38.80±7.19,各组差异具有统计学意义(F=23.96,P<0.01),通过两两比较可得出,HepG2细胞的L5-BT/SA-PEG-USPIO组与前三者的标准化T2M信号强度差异具有统计学意义(P<0.01),代表着预定位实验组特异性地改变了HepG2细胞的成像。6.裸鼠移植瘤体内磁共振成像显示移植瘤的T2WI信号强度在10min时降至最低,预定位组的移植瘤信号开始缓慢上升,在2h、4h及6h的图像中,信号升高程度缩小,但在对照组中,1h及1h后的图像可见到移植瘤的信号回升到平扫前的信号强度。普鲁士蓝染色显示肿瘤细胞内及细胞间隙大量的蓝染颗粒,GPC3免疫组化染色显示相应区域细胞高表达GPC3。相对信号强度-时间曲线图可清晰地看到预定位增强组在10 min时,信号达最低,并缓慢升高后进入平台期,信号改变不明显,而对照组在10 min时达到最低值后,信号从1h开始回升到平扫的状态。在1h、2h、4h及6h时间点,预定位增强组与对照组感兴趣区的相对信号强度的差异均具有统计学意义。结论：在本实验中,我们通过多肽介导的二步预定位方法,应用PEG修饰的纳米级对比剂,初步实现HCC的主动靶向MR成像。