研究背景缺血性脑卒中是一种高发病率和致残率的脑血管疾病,缺血缺氧性神经损伤为其显著特征,主要机制是由脑部血供减少或中断,导致神经细胞发生的一系列缺血缺氧性的病理损害。缺血性脑卒中,根据缺血后血供是否能够及时恢复,分为永久性缺血和缺血再灌注两种类型。但因缺血后恢复血液再灌注,必须在有限的4-6小时内完成,而一般病人缺乏相关专业知识,贻误治疗时机,导致大部分的缺血性脑卒中转变为神经细胞永久缺血缺氧性损伤。缺血性脑卒中的主要病理机制包括神经细胞缺氧、缺血后炎症反应、细胞凋亡、细胞坏死、梗死周围去极化等。缺血性脑卒中,尤其是神经细胞永久缺血缺氧性损伤的危害巨大,严重影响人们的健康,但临床治疗的有效性却十分有限。关于缺血缺氧脑损伤的研究主要集中于缺血再灌性损伤,而关于永久缺血缺氧性脑损伤的机制,仍不十分清楚,有待深入研究。近来有研究发现,自噬在炎症反应、循环系统和泌尿系统的缺血性损伤中,扮演促细胞存活的重要角色;但自噬在一些损伤中亦发挥促死亡的作用。因此,关于自噬在缺血缺氧性损伤中的作用,仍然存在巨大的分歧。自噬流是指自噬动态全过程,包括自噬膜生成、包绕待降解的细胞器形成自噬体、自噬体与溶酶体融合,以及溶酶体降解自噬体内容物等环节。任何一个环节出现问题,均可导致自噬失调。以往大部分研究,仅通过常见的自噬标志性蛋白LC3和Beclin-1等的表达情况,评价自噬的激活及发挥的作用,很容易导致对自噬角色的误判。这也许是目前关于自噬在缺血缺氧性神经损伤中的作用,存在巨大分歧的因素之一。而且,目前有关自噬在神经细胞缺血缺氧性损伤中作用的研究,主要集中于缺血后再灌注领域,但对于神经细胞永久缺血缺氧性损伤,自噬的作用及机制,尚有待研究。尤其在自噬如何调节神经细胞缺血缺氧性损伤,究竟发挥着何种作用,尚不明确。自噬的调节机制十分复杂,与许多信号通路存在交互作用,如凋亡通路及Notch通路等,而这些通路之间的交互作用,可能会影响自噬的最终结果。wnt/β-catenin信号通路以参与调节细胞增殖和胚胎发育而著名,最近的研究发现,在正常条件下自噬及wnt/β-catenin信号通路,存在一定的交互作用。但在永久缺血缺氧神经细胞损伤中,wnt/β-catenin信号通路在缺血缺氧条件下被激活已有文献报道,但在神经细胞永久性缺血缺氧性损伤中,尤其是wnt/β-catenin通路与自噬,是否存在交互作用,尚无相关报道,有待进一步研究。目的1、建立ogd模拟的永久缺血缺氧pc12细胞损伤模型,了解神经细胞永久缺血缺氧损伤的机制。2、分析自噬流相关蛋白在永久缺血缺氧性神经损伤中的表达,探讨自噬的活化情况,并评价自噬在损伤中发挥的作用。3、探讨wnt/β-catenin信号通路是否参与神经细胞永久缺血缺氧性损伤,以及自噬和wnt/β-catenin信号通路是否存在交互作用及其相互影响的机制。方法选用pc12细胞作为研究对象,ogd法(oxygenglucosedeprivation)复制神经细胞永久性缺血缺氧模型,应用自噬流作为评价自噬激活以及作用效果的方式。细胞分组:为了检测细胞损伤及自噬激活情况,细胞分为:对照组、ogd组0.5h,2h,6h,12h,24h;为了探讨自噬对ogd方式诱导的细胞保护作用,细胞分为:对照组、rp组(ogd6h+自噬激动剂rapamycin,)、3-ma组(ogd6h+自噬抑制剂3-ma)、mhy组(ogd6h+溶酶体抑制剂mhy1485)。应用hoechst33342染色、间接免疫荧光技术,共聚焦显微镜技术,从形态上评价缺血缺氧细胞的具体损伤情况,如细胞凋亡、hif-1α、cox2的表达变化等,使用mtt比色法、ldh检测法、流式细胞术、westernblotting对损伤情况量化分析,如细胞生存抑制率、细胞坏死率、凋亡率、hif-1α、cox2蛋白表达等量化分析。利用免疫荧光实验、激光共聚焦显微技术、透射电子显微术、westernblotting等实验技术及方式,分析在ogd0.5h、2h、6h、12h和24h自噬流的变化,如lc3、beclin1、p62等蛋白的表达情况,不同时间自噬体超微结构变化。通过干预自噬活化水平,观察细胞损伤变化,使用自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-ma)、溶酶体抑制剂(mhy1485)分别预处理细胞,干预细胞的自噬活化水平,将ogd6h作为短期和长期缺血缺氧的分界点,通过评估hif-1α及cox2在自噬增强及减弱情况下的变化,评价自噬在缺血缺氧性神经损伤中的作用。探讨经典wnt/β-catenin信号通路在神经细胞缺血缺氧性损伤中激活及与自噬的交互作用,利用westernblotting量化分析wnt/β-catenin信号通路的上游蛋白wnt1、wnt3a及下游蛋白dvl2、β-catenin和靶蛋白c-myc、cyclind,在对照组、ogd0.5h、ogd2h、ogd6h、ogd12h和ogd24h的表达情况,评价其在缺血缺氧中的激活情况,以及通过干预改变自噬活性水平,观察wnt/β-catenin信号通路以上关键蛋白的表达变化,探讨其与自噬的相互作用及调节机制。结果1、ogd诱导的氧化应激反应与ogd时间依赖性的关系。ogd诱导的永久性缺血缺氧损伤,导致细胞缺氧相关蛋白hif-1α、炎症相关蛋白cox2表达随ogd时间延长不断增高,并在ogd12h后与对照组相比显著增高,差异具有统计学意义(p<0.05)。乳酸脱氢酶释放率与ogd时间呈正性依赖关系,ogd12h后,与对照组相比显著提高,差异具有统计学意义(p<0.05)。细胞凋亡率与ogd时间呈正性依赖关系,在ogd6h后与对照组相比显著增高,差异具有统计学意义(p<0.05)。2、永久性缺血缺氧引起的自噬改变与ogd时间的关系。通过透射电子显微镜检测自噬超微结构,结果显示自噬体随着ogd时间的增加而不断增多。westernblotting结果显示,ogd模拟的永久性缺血缺氧,引起细胞自噬相关性蛋白lc3和beclin-1表达增高,并且lc3Ⅱ/Ⅰ比值,随ogd时间逐渐增高,ogd6h后显著增高,差异具有统计学意义(p<0.05)。p62蛋白的表达,随ogd时间增加而不断减少,与对照组比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。应用溶酶体抑制剂后,lc3Ⅱ/Ⅰ比值较对照组显著增高,差异具有统计学意义(p<0.05)。3、ogd诱导的永久性缺血缺氧与自噬的保护作用。应用自噬激动剂rapamycin预处理细胞后,ogd处理细胞6h,lc3表达增强,细胞存活率增加,ldh释放率减少,hif-1α、cox2表达减少;应用自噬抑制剂3-ma和自噬溶酶体抑制剂mhy预处理细胞,在ogd6h组,lc3表达减少,细胞存活率减少,ldh释放率增加,hif-1α、cox2表达增加。4、wnt/β-catenin信号通路与永久缺血缺氧中的自噬。westernblotting结果显示,wnt信号通路上游蛋白wnt1、wnt3a的表达,与ogd时间呈正性依赖关系,在ogd12h后显著增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。下游蛋白dvl2、β-catenin、c-myc和cyclind表达,与ogd时间呈负性依赖关系。当应用自噬激动剂后,自噬程度升高,wnt信号通路上游蛋白wnt1、wnt3a的表达增高,下游蛋白dvl2、β-catenin、c-myc和cyclind表达减少;应用自噬抑制剂3-ma和mhy后,自噬程度降低,wnt信号通路上游蛋白wnt1、wnt3a的表达降低,下游蛋白dvl2、β-catenin、c-myc和cyclind表达增加。结论1、ogd模拟的pc12细胞永久性缺血缺氧损伤,可以引起炎症、缺氧、细胞凋亡和坏死,且这些损伤与ogd时间呈正性依赖关系。2、永久缺血缺氧诱导自噬上调,自噬的活化水平与ogd时间呈正性依赖性。3、增强自噬,自噬流上调,在ogd诱导的缺血缺氧中,发挥神经保护作用。4、wnt/β-catenin信号通路在ogd诱导的永久性缺血缺氧中被激活,上游蛋白的表达与ogd时间呈正性依赖,中下游蛋白的表达与ogd时间呈负性依赖。5、wnt/β-catenin信号通路接受自噬对其的负性调节,二者共同发挥对pc12细胞永久性缺血缺氧损伤的神经保护作用。