在凝固酶阴性葡萄球菌引起的奶牛乳房炎中,木糖葡萄球菌是主要的分离菌并因其较高的分离率和严重的多重耐药现象引起广泛关注。细菌耐药性问题是全球关注的热点,目前的研究表明,细菌的耐药机制受其代谢途径的调控。L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,ldh)是一种与代谢密切相关的蛋白,本实验室前期研究表明其与木糖葡萄球菌对泰乐菌素的耐药性相关,然而其是否与木糖葡萄球菌多重耐药性相关及其潜在耐药机制尚不明确。针对以上背景,本研究以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,gfp)为筛选标记对实验室前期诱导的泰乐菌素耐药木糖葡萄球菌进行ldh基因的敲除与回补;以耐药株、耐药敲除株和耐药回补株为受试菌株,通过药敏试验检测其对大环内酯类、酰胺醇类、林可胺类、四环素类及氨基糖苷类兽医临床常用抗菌药物的耐药表型,阐明L-乳酸脱氢酶是否影响木糖葡萄球菌的多重耐药性;通过测定三羧酸循环(TCA循环)及硫氧还蛋白系统中的关键基因、酶活性和代谢物含量的变化来阐明L-乳酸脱氢酶是否通过调控以上途径而影响木糖葡萄球菌的多重耐药性,从而为开发针对代谢途径的新型药物提供理论基础。具体研究结果如下:(1)以gfp为筛选标记,通过基因敲除及基因回补技术成功构建了ldh基因缺失株及ldh基因回补株。(2)敲除ldh基因后,细菌对五类抗菌药物的耐药性均上升,其中细菌对泰乐菌素的最小抑菌浓度(MIC)上升了10倍;对红霉素的MIC上升了32倍;对林可霉素的MIC上升了512倍;对氟苯尼考的MIC上升了160倍;对金霉素、土霉素的MIC均上升8倍;对链霉素的MIC上升了1024倍,对庆大霉素的MIC上升了2倍。而回补ldh基因后,与敲除株相比,细菌对泰乐菌素、红霉素、氟苯尼考、金霉素及土霉素的MIC均下降2倍;对林可霉素、链霉素及庆大霉素的MIC均下降了4倍。(3)敲除ldh基因后,细菌中乳酸含量显著上升,丙酮酸和NADH含量显著下降,异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶在酶活性及m RNA水平均显著下调。而回补ldh基因后,以上指标均恢复至敲除前水平。(4)敲除ldh基因后,细菌中硫氧还蛋白还原酶活性显著上升、硫氧还蛋白在m RNA水平显著上调、活性氧含量显著下降。而回补ldh基因后,硫氧还蛋白还原酶活性和硫氧还蛋白的m RNA水平均恢复至敲除前水平。综上所述,L-乳酸脱氢酶是木糖葡萄球菌多重耐药的相关蛋白;敲除L-乳酸脱氢酶后,木糖葡萄球菌通过抑制TCA循环,调节细菌中硫氧还蛋白系统而促进多重耐药性的产生。